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MicroRNA蛋白水平实验

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MicroRNA蛋白水平实验
 
MicroRNA测序
 
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    技术优势通量高:一次测序得到500万条以上的序列;
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  • 研究内容
            基于Illumina HiSeqTM2000高通量测序技术的小RNA数字化分析,采用边合成边测序的方法,可减少二级结构造成的区域缺失。该技术可以对高质量序列进行序列长度分布的统计及样品间公共序列统计,将筛选后的高质量序列分类注释,从而获得样品中包含的各组分及表达量信息,并对所有小RNA片段进行注释,对新的miRNA则进行靶基因预测。
    一、标准信息分析数据产出统计,对原始测序数据去接头污染,去低质量reads;
  • 18~30 nt 小RNA 测序结果的长度分布;
  • 样品间的公共序列和特异序列的分析;
  • 小RNA在选定的参考基因组上的分布;
  • 小RNA与rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA的比对信息;
  • 小RNA与重复序列的比对信息;
  • 小RNA与外显子或内含子的比对信息;
  • 小RNA与miRBase 中指定范围的已知的miRNA的比对;
  • 按照优先级将小RNA进行分类注释;
  • 利用Mireap 对没有注释的small RNA进行预测,预测新的miRNA,绘制新的miRNA 的二级结构图;
  • 已知miRNA的表达谱构建;
  • 已知miRNA 的家族分析。
  • 二、高级信息分析(基于标准分析)已知miRNA和novel miRNA的靶基因预测;
  • 已知miRNA和Novel miRNA靶基因GO注释和KEGG;
  • 已知miRNA的碱基编辑分析;
  • 已知miRNA 差异分析和聚类分析;
  • Novel miRNA 差异分析(2个或2个以上样品)和聚类分析;
  • 差异miRNA 靶基因预测;
  • 差异miRNA 靶基因GO 注释和KEGG 通路分析。
 
【本平台合作项目】
分子诊断、病理诊断、药效学评价、毒理学实验、细胞药筛、动物建模、PDX模型、CRISPR/Cas9基因编辑、病理检测、基因芯片、蛋白组学、代谢组学、高通量测序、ChIP、CO-IP、生物信息学分析、知识产权服务!
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 小RNA是一类重要的体内调节分子,主要包括miRNA、piRNA和siRNA。它的功能主要是诱导基因沉默,参与基因转录后调控,从而调节细胞生长、分化,以及个体发育、生殖等重要生物学过程。小RNA测序技术采用胶分离技术,收集样品中18-30nt的RNA片段,利用高通量测序技术,一次性获得单碱基分辨率的数百万条小RNA序列信息,依托强大的生物信息分析平台,鉴定已知小RNA,并预测新的小RNA及其靶标基因。技术优势 通量高:一次测序得到500万条以上的序列; 分辨率高:可以检测小RNA单个碱基的差异; 精准度高:从几个到数十万个拷贝精确计数; 不依赖已知信息:既能鉴定已知小RNA,又能发现新小RNA; 可重复性高:深度测序保证了抽样随机性,重复性非常好,无需重复实验。研究内容        基于Illumina HiSeqTM2000高通量测序技术的小RNA数字化分析,采用边合成边测序的方法,可减少二级结构造成的区域缺失。该技术可以对高质量序列进行序列长度分布的统计及样品间公共序列统计,将筛选后的高质量序列分类注释,从而获得样品中包含的各组分及表达量信息,并对所有小RNA片段进行注释,对新的miRNA则进行靶基因预测。一、标准信息分析 数据产出统计,对原始测序数据去接头污染,去低质量reads; 18~30 nt 小RNA 测序结果的长度分布; 样品间的公共序列和特异序列的分析; 小RNA在选定的参考基因组上的分布; 小RNA与rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA的比对信息; 小RNA与重复序列的比对信息; 小RNA与外显子或内含子的比对信息; 小RNA与miRBase 中指定范围的已知的miRNA的比对; 按照优先级将小RNA进行分类注释; 利用Mireap 对没有注释的small RNA进行预测,预测新的miRNA,绘制新的miRNA 的二级结构图; 已知miRNA的表达谱构建; 已知miRNA 的家族分析。二、高级信息分析(基于标准分析) 已知miRNA和novel miRNA的靶基因预测; 已知miRNA和Novel miRNA靶基因GO注释和KEGG; 已知miRNA的碱基编辑分析; 已知miRNA 差异分析和聚类分析; Novel miRNA 差异分析(2个或2个以上样品)和聚类分析
small RNA测序介绍Small RNA(包括miRNAs、siRNAs和piRNAs等)是生命活动中重要的调控因子,在基因表达调控、生物个体发育、代谢紊乱发挥着重要的作用。基于Illumina高通量测序平台的small RNA测序技术不受物种限制,具有高灵敏度和高精确性,既能鉴定特定条件下表达的miRNA,也能发现新的miRNA。同时还可用生物信息学分析筛选在特定条件下差异表达的miRNA。 欧易特色● 高度灵活性:可研究任一17~35 nt之间小RNA分子● 高度精确性:可精确到单核苷酸水平,非常有利于区分高度同源的小RNA分子和鉴定小RNA的多态性● 检测动力学范围广:可在超过6个数量级范围内实现准确的序列检测和定量分析,有利于低丰度小RNA差异表达的研究● 数据质量高:深度测序保证了抽样随机性,可靠性和重复性高,与实时定量PCR结果具有较高的一致性 small RNA测序项目流程 数据分析内容标准数据分析● small RNA测序数据预处理 ·数据处理统计 ·Reads长度分布统计·Reads拷贝数统计● 序列比对注释高质量Ref tag构建·参考基因组比对 ·miRBase数据库比对注释·Rfam数据库比对 ·Gene比对 ·Repbase比对·Reads分类注释汇总● 已知miRNA鉴定  ● 新miRNA预测·新miRNA预测 ·新miRNA二级结构预测● miRNA差异分析(已知/新预测)·miRNA表达量统计 ·miRNA差异筛选● 差异miRNA靶基因预测(已知/新预测)·差异miRNA靶基因预测·差异miRNA靶基因GO富集分析·差异miRNA靶基因KEGG富集分析 small RNA测序样品要求● Total RNA:≥2 μg ,浓度≥400 ng/μl● OD260/280为1.8-2.2● 适用范围:真核生物(有、无参考基因组皆可) 常见问题● 1. Small RNA测序后进行RT-PCR验证时,常会出现非特异性扩增,如何解决?因为miRNA序列比较短,彼此间相似度又非常高,尤其是同一家族的miRNAs,彼此间可能只有1个碱基差异,出现非特异性扩增是很正常的,建议使用Taqman探针法进行尝试。● 2. 没有参
SSAM-06:pri-microRNA 基因预测 本方案将采用双向BLAST和synteny分析识别保守与非保守的pre-miRNA。并分析pre-miRNA侧翼序列用以识别pri-miRNA的5’和3’边界。分析pri-miRNA的侧翼序列长度与边界在同源miRNA中的分布情况。注释pri-miRNA的结构,及其pre-miRNA。pri-miRNA在物种间的保守性。分析预测的pri-miRNA的上游序列、下游序是否与启动子调控序列向关联。   分析方法与步骤:(1)pre-miRNA序列获取:分析具有注释的pre-miRNA在基因组中的定位,进而确定miRNA与编码蛋白基因进而已具有注释基因的覆盖率。(2)miRNA的保守性分析:syntenyanalysis,pre-miRNA的邻近基因与在其他物种中的pre-miRNA的同源基因序列匹配;针对某物种中的保守的和非保守性pre-miRNA分别进行考察。(3)获取pre-miRNA侧翼序列区域,对于intergenicmiRNA,如果他与任意邻接的转录本序列重叠,我们截取掉侧翼序列区域。(4)转录特征提取,分析7种转录特征:转录起始位点(TSS),CpG岛,ESTs,cDNA,polyA信号,5’CAGE和GIS-PET。这些特征用来预测别pri-miRNA的5’和3’边界。intronicmiRNAs一般被认为是与hostgene一起被转录的。pri-miRNA在这种情况下就是host编码蛋白的转录本。因此这类intergeneticmiRNA被识别预测出来。pri-miRNA的5’端可以根据靠近上游侧翼序列区域的TSS,CpG,和5’CAGEtag预测匹配得到注释。类似的,3’端可以根据下游序列区域上的polyA信号和3’ditags得以区分。同时,通过EST和cDNA分析比对,ETS和cDNA可以提供对应的转录证据。最终,预测得到的pri-miRNA可以用于进一步考察和启动子相关的调控序列。------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ MicroRNA(miRNA
 small RNA 测序      Small RNA是生物体内一类重要的调控分子,参与细胞生长、发育、代谢、基因转录和翻译等诸多生物学过程,在疾病的发生发展转归的病理过程中也具有非常重要的作用,是一类新的极具开发潜质的生物标志物和药物靶标。新一代测序技术的高通量、高灵敏性、高精确性、低样品需求量、操作简便等特点,为在基因组范围内快速研究任一物种已知的small RNA的表达情况和预测挖掘新的small RNA调控分子提供了强有力的技术工具。本公司在多年miRNA表达谱芯片服务的基础上,推出基于Illumina GAIIx 的small RNA测序服务,结合illumina新推出的TruSeq样品制备、簇生成和测序试剂以及升级更新的算法软件,降低了测序过程中的GC偏向性,提高了测序覆盖度和均一性,测序数据更加准确、可靠。一、实验流程二、技术优势·         高度开放性:无需预先了解序列信息和二级结构,即可研究任一物种已知的小RNA分子和预测新的小RNA分子。·         高度灵活性:可研究任一17~35nt之间小RNA分子。·         高度精确性:可精确到单核苷酸水平,非常有利于区分高度同源的小RNA分子和鉴定小RNA的多态性。·         检测动力学范围广:可在超过6个数量级范围内实现准确的序列检测和定量分析,有利于低丰度小RNA差异表达的研究。·         保持链特异性信息:保留了小RNA的原始链定位信息,有利于研究小RNA的表达调控机理。·         数据质量高:深度测序保证了抽样随机性,可靠性和重复性高,与实时定量PCR结果具有较高的一致性。三、数据分析·         原始数据产出统计·         已知 small RNA注释:miRNA, siRNA, piRNA, rRNA, tRNA, snRNA, snoRNA, repeat asscociated sRNA等·         降解片段鉴定:mRNA, exon, intron等·         预测新的 miRNA·         miRNA同源性结构分析·         miRNA表达谱聚类分析·         miRNA差异表达分析·         miRNA靶基因预测·      

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