实验目的:检测组织或细胞中特定目的蛋白的含量。
实验原理:将蛋白样本通过聚丙烯·酰胺电泳按分子量大小分离,再转移到杂交膜上,然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。其中的步骤包括蛋白样本提取制备,蛋白定量,电泳,转膜与显色。
实验材料:
试剂:蛋白(全/核/膜/胞浆)提取试剂盒、蛋白定量试剂盒、SDS凝胶电泳上样缓冲液、电泳缓冲液、封闭液、一抗、二抗、ECL发光液、显影液、定影液。
仪器:匀浆器、紫外分光光度计、bio-rad电泳仪、恒温箱。
实验内容与方法:
1、 蛋白提取:根据需要测定的目的蛋白主要来源(胞浆、胞核或者全蛋白),区分组织提取或者细胞提取,选取相应的试剂盒。
2、 蛋白定量:bradford法、BCA法或lowery法测定出所提取的蛋白含量。
3、 蛋白变性:5×电泳上样缓冲液,煮沸5~10分钟。
4、 凝胶电泳:垂直电泳分离出目的蛋白条带。
5、 转膜:将SDS丙烯·酰胺中的蛋白通过水平电泳的方式转移到PVDF或者NC膜上。
6、 免疫反应:目的蛋白分别与相应的一抗、二抗结合。
7、 显色反应:通过化学发光法将蛋白条带显影至胶片上。
客户提供实验信息:
1、 实验信息(客户提供):
样本来源: 细胞 种属来源__________ 或 组织 组织来源_________
样本数量:__________ 检测蛋白信息:目的蛋白名称_______________ 蛋白分子量_________
主要表达部位(选填)_______________________ 一抗信息:抗体名称________________________ 种属来源__________
购买公司______________ 推荐工作浓度(选填)_________
2、实验材料提供: (1)样本材料: 新鲜或冷冻细胞不少于106个,新鲜或冷冻组织样本不少于50 mg。 已提取的蛋白样品蛋白含量不低于0.1ug/ul。 (2)试剂:蛋白提取与定量可根据客户要求选用特定试剂盒,如客户不提供 试剂盒且无特别要求,则选用凯基公司相应试剂盒产品。一抗二抗反应所用抗体客户自备,凯基也可以提供抗体代订服务。 服务周期:(2到8周,根据样本数量而定) 结果提交:提交实验报告书(包括实验材料、试剂、仪器、实验过程方法、结果及分析)、原始数据、图片,文本或电子版。 实验范例: 小鼠骨骼肌组织中myoglobin蛋白电泳条带 beta-actin内参条带 灰度分析
检测蛋白 |
样品 编号 |
阳性 面积 |
阳性平均灰度 |
背景 灰度 |
净灰度 |
阳性 灰度积 |
内参值 |
阳性比 |
Myoglobin |
1 |
1443 |
174 |
168 |
6 |
8658 |
463749 |
0.019 |
2 |
8043 |
206 |
165 |
41 |
329763 |
401676 |
0.821 |
3 |
8368 |
212 |
163 |
49 |
410032 |
289212 |
1.418 |
4 |
10105 |
218 |
163 |
55 |
555775 |
370691 |
1.499 |
5 |
10927 |
219 |
162 |
57 |
622839 |
357770 |
1.741
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