pDe-CAS9-D10A载体/pDe-CAS9-D10A质

pDe-CAS9-D10A 载体/pDe-CAS9-D10A 质粒图谱/pDe-CAS9-D10A 质粒序列

 

【产品简介】

 

产品货号：P10824

 

质粒名称：pDe-CAS9-D10A

 

质粒别称：等效质粒 Plasmid#61477

 

拷贝数：高

 

质粒长：16467bp

 

质粒宿主植物

 

质粒用途：基因敲除

 

片段类型：CRISPR

 

片段种属：合成

 

原核抗性：Chl

 

筛选标记：Neo/G418

 

荧光蛋白：

 

蛋白标签：

 

启动子：UBI

 

复制子：pVS1

 

感受态：DB3.1

 

培养温度：37 度

 

正向引物：

 

反向引物：

 

诱导方式：

 

空载名称：

 

【干粉质粒操作说明】

 

一、操作方法

 

1、收到干粉质粒后请先 5000rpm 离心 1min,再加入 20ul 无菌水溶解质粒;

 

2、将相应的感受态于冰盒上解冻，取 5ul 质粒加至 100ul 感受态中，冰浴 30min;

 

3、42 度热激 60s，冰浴 2min，加入 900ul 无抗 LB 培养基，180rpm 震荡培养 45min;

 

4、6000rpm 离心 3min，留 100ul 上清重悬，再涂至对应抗性的 LB 平板上;

 

5、倒置培养过夜后，如菌落过多则稀释质粒转化，如没有菌落则取 10uI 质粒转化

 

6、挑单菌落至对应抗性的 LB 液体培养基中过夜震荡培养，根据需要提取质粒。

 

7、保存条件：-20℃ 保质期：90 天

 

二、注意事项

 

1、种子质粒：本产品为种子质粒，直接转染效率极低，必须转化扩增后使用。

 

2、菌落数量控制：平板菌落数以 10~300 个为佳，过多或过少均可能影响后续单克隆筛选。

 

3、测序验证：提取质粒后，建议进行测序验证（至少一个反应），确保序列正确。

 

4、转化条件：转化前请核对质粒的抗性和感受态类型，严格按照感受态说明书操作。

 

5、剩余质粒：溶解后的干粉质粒需-20℃保存，但反复冻融会降低转化效率，建议分装后冻存。

 

【质粒 DNA 转化】

 

一、操作步骤：

 

1. 从-80℃冰箱中取出对应的感受态细胞，室温下置于冰盒上解冻，标记;

 

2. 向感受态细胞中加入 2µl 的质粒，置于 4℃冰箱中,冰浴 30min;

 

3. 在 42℃水浴锅中热激 1min，然后立即在冰盒上放置 2min；

 

4. 每管加 900µl LB 培养基，37℃摇床震荡,150rpm×45min；

 

5. 取 100µl 转化液加入对应抗性的平板中，倒入适量玻璃珠，涂匀液体；

 

6. 将平板倒置于 37℃恒温培养箱中培养过夜。

 

二、注意事项：

 

1. 感受态可用灭菌的离心管分装使用。

 

2. 根据需要在第 5 步骤时将转化液 6000rpm 离心 3min，然后只留下 100µl 左右的上清液，混匀沉淀，全部加入相对应的平板中。

 

3. 转化过程在超净工作台中进行。

 

4.质控标准：不要长太小 太密或培养时间过长，菌体大小适中 对着光看饱满透亮，平板不要长太多卫星菌落。

 

【质粒 DNA 提取】

 

一、实验原理：

 

碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒 DNA 与线性染色体 DNA 在拓扑学上的差异来分离它们。在 pH 值介于 12.0 ～12.5 这个狭窄的范围内，线性的 DNA 双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒 DNA 的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入 pH 4.8 的乙酸钾高盐缓冲液恢复 pH 至中性时，共价闭合环状的质粒 DNA 的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体 DNA 的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体 DNA 与不稳定的大分子 RNA ，蛋白质-SDS 复合物等一起沉淀下来而被除去。

 

二、操作步骤：

 

1. 准备 20ml 灭菌过的培养管，编号，分别加入 8ml LB 培养基，再加入 8µl 相应抗生素，可适量多加；

 

2. 用 10µl 白色枪头挑取挑取单个菌落至培养管中，37℃震荡过夜（274rpm）；

 

3. 取 2ml 过夜培养的菌液加入离心管中，室温 10000rpm 离心 2min，去上清；（可重复步骤 2，直至菌液离心完）（去上清时用纸吸一下）

 

4. 向留有菌体沉淀的离心管中加入 250µl Buffer P1（含 RNase A），使用移液枪充分混匀，悬浮菌体菌体；

 

5. 向离心管中加入 250µl Buffer P2，温和地上下颠倒混匀 4~6 次，获得澄清的裂解液；（剧烈混合会使剪切染色体 DNA，降低质粒纯度）

 

6. 向离心管中加入 350µl Buffer N3， 立即温和地上下颠倒混匀 4~6 次，此时出现白色絮状沉淀。室温 10000rpm 离心 15min；

 

7. 小心将步骤 6 中所得的上清液转移至洁净的吸收柱中。要保证没有吸入沉淀和细胞碎片。室温 10000rpm 离心 1min，至裂解物完全通过吸收柱,倒掉收集管中的废液；

 

8. 向吸附柱中加 150µl Buffer PB，10000rpm 离心 1min，倒掉收集管中的废液；

 

9. 向吸附柱中加 400µl Buffer PW（检查是否加入无水乙醇），10000rpm 离心 1min，倒掉收集管中的废液。再空离一次，2min（此时可以加热 Buffer EB，65~70℃）；

 

10. 将吸附柱置于一个新的离心管中，打开盖子，吹风 4min 左右（确保乙醇被去除，乙醇会影响下面的步骤）；

 

11. 向吸附柱的吸附膜中间部位加 90µl Buffer EB（pET 系列拷贝数低，加 EB 70μl 即可），室温静置 2min。10000rpm 离心 1min；

 

12. 把液体倒回吸附柱，在 10000rpm 离心 1min；

 

13. 混合质粒至一个离心管中，做好标记，开盖室温放置两小时左右。-40℃保存质粒。

 

三、注意事项：

 

1.使用之前，把试剂盒中的一小管 RNA 酶加入 Buffer P1， 4℃保存。

 

2.Buffer EB 在 65~70℃水浴预热，可以增加提取效率。