4367659赛默飞Green PCR预混液实验室实时荧光定

荧光定量 PCR 异常扩增曲线分析攻略

PCR 预混液跟核酸模板加好后是否混匀，如果没有混匀，特别是样本体积比较大的时候（超过 PCR 体系的 20%），更容易发生 optical mixing 现象。因为样本是水相会在上层，试剂（含有甘油成分）会在下层，在前期的 PCR 过程中不足以混匀完全，这样会形成折射，荧光较强，而一般加热几个循环后样本跟预混液会混匀，荧光就变稳定了（图十）。 图十：样本跟预混液未混匀现象 还有上机的反应体系里尽量不要有大的气泡，有气泡的话，中间容易形成折射，干扰荧光的采集（图十一）。所以实时荧光定量 PCR 实验

PCR 新手指南——手把手教您如何正确选择合适的 PCR 酶

酶。 图 1.非特异性扩增（左图）与使用热启动 DNA 聚合酶进行的特异性扩增（右图）。 如何为您的 DNA 聚合酶选择正确的形式 还有更多需要考虑的因素。选择可以简化您工作流程的聚合酶形式。PCR 聚合酶形式的选择包括即用型预混液、用于直接凝胶上样的含染料缓冲液以及用于直接 PCR 分析的所有必要成分的完整试剂盒。 使用预混液，您只需添加模板和引物，然后，开始 PCR 实验。如果您想进一步减少操作步骤，使用含染料缓冲液的聚合酶允许 PCR 产物直接凝胶上样（注意：确保染料与下游应用兼容）。直接

荧光定量 PCR——想要实验结果可靠，各种对照不可少

和台面上残留的 DNA 和 RNA。 试剂组分的污染 按照标准 PCR 实验室的分区要求，在清洁度最高的「试剂储存和准备区」进行试剂的制备、分装和预混液的制备。大包装的 qPCR 试剂开封后进行分装，以减少反复冻融和吸取次数。在做多样本 PCR 反应时，先配制反应混合液分装至反应管中，最后加入样本核酸。避免同时开盖，实现完全闭管操作。实验试剂应与样品和 PCR 产物分开保存，不应放于同处。 前次 PCR 扩增产物和引物残余污染 标准的 PCR 实验室分区通过「标本制备区