BeyoTSA™四标五色多重荧光染色试剂盒

碧云天的BeyoTSA™四标五色多重荧光染色试剂盒，英文名为BeyoTSA™ Quadra Label Five-Color Multiplex Fluorescence Staining Kit，简称多重免疫组化染色(mIHC)、多重荧光组化、多色免疫荧光(mIF)、荧光多色标记或多重染色，是一种基于酪酰胺信号放大技术对细胞或组织样品进行多重荧光染色的试剂盒。

本试剂盒可同时标记和检测1-4种目的蛋白。本试剂盒包含Tyramide-488、555、594和647四种荧光染料，配合相应一抗和二抗，可同时标记最多四种目的蛋白，一抗使用量少、荧光强度高、信号稳定，可用于多色标记和定位研究，尤其适用于低丰度靶标和复杂样品的检测。本产品适用于石蜡切片、冰冻切片、细胞爬片、细胞涂片等细胞或组织样品的多重荧光染色。

本试剂盒可以突破多重免疫荧光染色时的抗体种属限制。本试剂盒每种抗体染色后可以去除相应的一抗和二抗，因此对于一抗的种属来源没有特殊要求，既适用于相同来源的一抗，也适用于不同来源的一抗。本试剂盒采用的TSA技术几乎完美解决了抗体种属选择的限制，在设计抗体组合时只需根据各抗体的效价和相应的荧光颜色选择最`优的抗体[1]。

酪酰胺信号放大(Tyramide signal amplification)技术，简称TSA，也称催化信号放大(Catalyzed signal amplification/CSA、Catalyzed reporter deposition/CARD)技术，由于其信号放大及多重染色的特点，被广泛应用于IF (Immunofluorescence)、IHC (Immunohistochemistry)和ISH (In situ hybridization)等技术中，是检测细胞和组织中极低丰度或低丰度的靶抗原最灵敏的方法之一，在不损失样品分辨率的条件下可以显著提升靶抗原检测的精度和灵敏度。

TSA是一种基于酶催化反应的高灵敏度信号放大技术，其主要原理是通过辣根过氧化物酶(HRP)催化酪酰胺底物(Tyramide-substrate，如Tyramide-488、Tyramide-Biotin等)生成含高活性自由基(Free radicals)的酪酰胺底物，即活性酪酰胺底物(Active Tyramide-substrate)，这些自由基与邻近蛋白质如酪氨酸残基(Tyrosine residues)共价结合，从而在目标位点附近(约0.1-1μm)沉积大量标记物(如特定的荧光探针或生物素等)，实现信号级联放大[1-3]。本系列试剂盒信号级联放大的原理请参考图1A。在第一轮一抗和二抗孵育以及TSA Reagent反应结束后，可以通过增强型免疫染色抗体洗脱液或热修复法去除非共价结合在靶抗原上的抗体复合物，同时又稳定保留共价结合的荧光探针。后续可不必考虑上一轮实验中抗体的交叉干扰，即可直接使用不同或相同种属来源的抗体进行后续轮次的孵育，从而标记其它靶抗原。如此重复循环染色，待所有抗体及对应酪酰胺底物孵育结束后，再进行所有染色结果的检测，实现同一个样品上的多重荧光染色(图1B)。

图1.碧云天BeyoTSA™系列产品的检测原理图。图A为TSA技术的原理图，图B为BeyoTSA™多重荧光染色的流程图。

本试剂盒采用了TSA信号放大技术，极大提高了检测灵敏度。TSA技术具有极高的检测灵敏度和精度，可以用于传统方法无法检出的低丰度靶抗原的检测，大大降低抗体的用量。本系列试剂盒的检测效果参考图2。

图2.碧云天BeyoTSA™系列产品的效果图示例。BeyoTSA™三标四色多重荧光染色试剂盒(488/555/647/DAPI) (P1351)检测肺部组织石蜡切片，如图所示，石蜡切片分别经BeyoIHC™系列的BeyoIHC™ CD21 Rabbit Monoclonal Antibody (AG8208)、BeyoIHC™ Cytokeratin 7 Rabbit Monoclonal Antibody (AG8352)、BeyoIHC™ p63 Rabbit Monoclonal Antibody (AG8597)及对应二抗辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L) (A0208)、相应的BeyoTSA™酪酰胺底物进行3轮染色循环后，对组织样品的多靶点实现了多重荧光染色。实验检测效果因实验条件、检测仪器和抗体等的不同而存在差异，图中效果仅供参考。

本试剂盒采用了的新型增强型免疫染色抗体洗脱液，无须37ºC孵育，通常仅需室温孵育10分钟就能有效洗脱抗体。和常规的免疫染色抗体洗脱液相比，操作更简单、洗脱更高效、条件更温和。

本试剂盒与Thermo公司的Tyramide SuperBoost™ Kits with Alexa Fluor™ Tyramides属于同类型产品，使用效果基本一致。

对于组织切片、细胞爬片或涂片、96孔板细胞样品，按照每个样品需要50μl TSA染色工作液计算，本试剂盒小包装可用于100个样品的靶蛋白的四重荧光标记检测。如果用于靶蛋白的单色荧光标记，可以检测的样品数量约为四色荧光标记的4倍。

包装清单：

产品编号	产品名称	包装
P1353S-1	BeyoTSA™ Tyramide-488 (200X)	25μl
P1353S-2	BeyoTSA™ Tyramide-555 (200X)	25μl
P1353S-3	BeyoTSA™ Tyramide-594 (200X)	25μl
P1353S-4	BeyoTSA™ Tyramide-647 (200X)	25μl
P1353S-5	TSA Reaction Buffer	30ml
P1353S-6	增强型免疫染色抗体洗脱液	40ml
P1353S-7	DAPI染色液	5ml
P1353S-8	组织自发荧光淬灭剂(首次使用前加3ml无水乙醇)	2ml (+3ml)
P1353S-9	抗荧光淬灭封片液	2ml
－	说明书	1份

保存条件：

-20ºC保存，一年有效。其中BeyoTSA™ Tyramide-488/555/594/647、DAPI染色液和组织自发荧光淬灭剂须避光保存。

注意事项：

须根据实际检测设备荧光通道的具体参数选择合适的酪酰胺底物或多重染色试剂盒。BeyoTSA™ Tyramide-substrate的荧光光谱信息见附录。碧云天是以激发波长进行酪酰胺底物的命名，有些同类产品可能是以发射波长进行命名，请注意区别。

如果需要更多的TSA Reaction Buffer、增强型免疫染色抗体洗脱液、DAPI染色液、组织自发荧光淬灭剂和抗荧光淬灭封片液，可以单独向碧云天订购TSA Reaction Buffer (P1451)、增强型免疫染色抗体洗脱液(P1455)、DAPI染色液(C1006)、组织自发荧光淬灭剂(P0122)和抗荧光淬灭封片液(P0126)。酪酰胺底物单品、单标酪酰胺信号放大试剂盒及其它多重荧光染色试剂盒详见相关产品。

组织自发荧光淬灭剂第一次使用前请按照包装上的指示添加相应量的无水乙醇，混匀，并在瓶上做好标记。

荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

若短期内使用频繁，可置于4ºC保存，至少1-2周内有效。宜尽量减少反复冻融。

相关洗涤，建议在翘板摇床(也称侧摆摇床)上进行，推荐使用BeyoShaker™数字式翘板摇床(E6673)。

组织自发荧光淬灭剂对人体有害，操作时请小心，并注意有效防护以避免直接接触人体或吸入体内。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。