NHS琼脂糖磁珠试剂盒(10-30μm) Magrose N

产品简介
NHS磁珠试剂盒表面为NHS基团修饰，能够与带有伯胺基团的蛋白和其他分子形成稳定的肽键，用于亲和纯化抗体、抗原和其他生物分子。与传统的羧基、氨基磁珠相比，表面含NHS基团的磁珠无需事先采用EDC/NHS或戊二全进行活化，只需简单地将含伯氨基的生物配体溶解在试剂盒自带的CouplingBuffer中，室温下将蛋白与NHS磁珠混合1~2h便可将生物配体共价偶联到磁珠上，具有操作简单、偶联条件温和、生物配体偶联快速高效等优点。磁珠偶联过程必需在不含任何氨基的缓冲溶剂中进行。人工操作时，使用磁性分离架实现磁珠与溶剂分离。也可采用自动化设备操作，自动化操作适合用于多样品的筛
选。

基本信息

粒径：   10~30µm 
材质：   琼脂糖 
结合能力：   20~30mg兔IgG/mL磁珠 
浓度：   20% (V/V)
保存液：   无水异丙醇

蛋白偶联操作流程图及优化点
1. 其中磁珠洗涤要严格按照说明书采用冷却的Washing Buffer A快速洗涤 ，以防磁珠在洗涤过程中NHS 基团水解。
2. 蛋白偶联过程中， 首先要通过实验确定合适的Coupling Buffer（主要包括 Coupling Buffer A;Coupling Buffer B; 50mM硼酸溶液，pH8.5; 100mM磷酸缓冲液，100mM NaCl，pH7.4这四种）。
3. 确定合适的Coupling Buffer后，再以此Coupling Buffer为基础，确定合适的偶联蛋白浓度，因为蛋白浓度越高，偶联到磁珠上的蛋白的量会越大（这是由于 NHS 基团跟蛋白偶联和 NHS 基团本身水解是一
对竞争反应）。当然此处要综合考虑使用性能和成本，有些客户偶联少量的蛋白便可满足使用需求，这时采用低浓度的蛋白便可，这样可以降低成本。
4. 封闭这一步可以采用试剂盒中自带的 3M 乙醇安，也可使用 Tris 缓冲液（100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 8.0），封闭时间不得低于 2h，如果化学封闭后背景仍然很高，还可以额外加一步 BSA 封闭。

蛋白偶联操作步骤
以下操作过程以取磁珠样品 500μL，采用 1.5mL EP 管，使用磁珠为Mag NHS 为例介绍。为例介绍。用户可根据自身需求按比例调整：

1. 蛋白溶液配制
取适量待偶联蛋白用Coupling Buffer溶解，配成浓度为0.1-3.0mg/mL的蛋白溶液（若使用的是Magrose NHS，则配成溶度为≥3.0mg/mL的蛋白溶液）。已经保存于buffer 中的蛋白，需要通过透析或者脱盐的方法彻底除去原有buffer里含伯胺基的物质，然后再用Coupling Buffer配成浓度为0.1-3.0mg/mL的蛋白溶液（若使用的是Magrose NHS，则配成溶度为≥3.0mg/mL的蛋白溶液），将配制好的蛋白溶液于4ºC保存备用。
注：(1)为了达到更好的性能，当蛋白浓度≥2mg/mL 时，此时偶联效率会更高，不过需根据成本和使用要求综合考虑；(2)蛋白溶液中不能含有带伯氨基的成分，比如 Tris，甘氨酸，明胶，BSA 等；

2. 磁珠清洗
a) 取 500μL 磁珠于 1.5mL EP 管中。
注：磁珠取样前要反复颠倒、使用涡旋振荡器或者垂直混合仪使其混合均匀，以保证实验的同一性。
b) 将 EP 管置于磁性分离架内，富集磁珠，去除上清液。
c) 加 1mL 2~8ºC 的预冷的 Wash Buffer A于 1.5mLEP 管中，涡旋 15s，使磁珠混合均匀。
d) 将 EP 管置于磁性分离架内，富集磁珠，去除上清液。

3. 生物配体固定
a) 加 500μL 蛋白溶液于 EP 管中，涡旋 30s，使其混合均匀。
注：磁珠洗涤后要立即加入蛋白溶液。
b) 将 EP 管涡旋 15s，置于垂直混合仪上，室温混合 1~2h。如果垂直混合不均匀，则反应前 30min，每隔 5min 取下 EP 管涡旋 15s。此后，每隔 15min，取下 EP 管涡旋 15s。
注：如有需要可以在 4ºC 反应过夜。
c) 采用磁性分离架富集磁珠，保存流穿液。

4. 磁珠封闭
a) 加 500μL Blocking Buffer于 EP 管中，涡旋 30s，将 EP 管置于磁性分离架内，富集磁珠，弃上清液。
注：Blocking Buffer除了试剂盒中提供的 3M 乙醇安外，也可以使用 100mM Tris-HCl, 150mM NaCl, pH8.0 等其它封端试剂。
b) 重复“步骤 a)”操作四次。
c) 加 500μL Blocking Buffer于 EP 管中，涡旋 30s，将 EP 管置于垂直混合仪中室温反应 2h。
d) 将 EP 管置于磁性分离架内，富集磁珠，弃上清液。
e) 加 1mL 超纯水于 EP 管中，充分混合，用磁力架富集磁珠，弃上清液。

5. 保存
a) 加 1mL Storage Buffer（需客户自备，比如含 0.05%叠蛋化钠的 PBS 缓冲液，或者客户根据自己实际需求选择合适的保存溶液 ）于 EP 管中，充分混合，用磁力架富集磁珠，弃上清液。重复该操作 2 次。
b) 加入 500μL Storage Buffer 于 EP 管中，充分混合，4ºC 保存备用。
注：最终偶联蛋白后的磁珠浓度为 10mg/mL。（若使用的是 Magrose NHS 磁珠，则为 20% （V/V））

注意事项
1. 磁珠对水分敏感。为了保证产品质量，在取样之后需立即盖上瓶盖，并用封口膜密封，于 4℃保存。
2. 禁止将磁珠干燥或冷冻。干燥和冷冻操作可能导致磁珠的聚集从而丧失结合活性。
3. 可通过间接法测定反应前后蛋白含量，或通过直接法检测偶联到磁珠表面的蛋白含量，使用 280nm 附近的波长来测定蛋白含量是不可取的，因为 NHS 基团在 280nm 波长附近有很强的吸收，会严重干扰检测结果。
4. 蛋白稳定剂（如 BSA，gelatin）会抑制抗体与磁珠的结合，因此在磁珠偶联抗体过程中，需要确保抗体保存体系中不存在含伯氨基的蛋白稳定剂。
5. 缓冲液中含有带伯胺的物质会抑制蛋白质偶联到磁珠表面，去除伯胺物质可采用透析和脱盐的方法。
6. NHS 基团易水解，故在用 Washing Buffer A 洗涤时，一定要参照说明书进行。
7. 蛋白溶液要预先配制好，Washing Buffer A 洗涤完毕后，要立即加入蛋白溶液进行偶联反应。
8. 蛋白质和磁珠的偶联效率因蛋白质种类和性质差异而不同。一般而言，蛋白质浓度为 0.1-3.0mg/mL 时利于蛋白质偶联；然而，对于不同的蛋白其浓度需要优化。