重组霍乱毒素B亚基（CF568标记，红色荧光）

背景描述

霍乱毒素（Cholera toxin，CTX）是霍乱弧军产生的毒力因子，会引起严重腹泻以及人体脱水。CTX属于AB5亚基家族。天然六聚体蛋白含两个亚基，分子量约85kDa。由一个A亚基（约27.2kDa）和五个B亚基（约11.6kDa/亚基）组成，B亚基以五聚体环的方式排列，呈明显的五度对称，负责毒素识别并吸附细胞表面的神经节苷脂GM1。

A亚基催化刺激性G蛋白α亚基（Gαs）的ADP核糖基化，降低GTPase活性和活化α亚基。Gαs的活化引起腺苷酸环化酶（AC）活性增加，进而促使cAMP水平提高。A亚基还能ADP核糖基化视杆细胞外节膜盘的转运蛋白，使得GTPase失活。霍乱毒素还是一种高效的黏膜疫苗佐剂，通过抑制IL-12生产来诱导2型辅助性T细胞的免疫应答。

霍乱毒素B亚基（CTB）对细胞无毒，本质上不含腺苷酸环化酶活性。CTB通过结合神经节苷脂GM1附着到细胞上，是小胶质细胞的良好标记物（这类细胞表面富含神经节苷脂GM1），但不适合标记少突胶质细胞或星形胶质细胞。

CTB是利用组化方法研究轴突运输的优秀示踪剂。CTB也是常用的脂筏标记物，脂筏是富含胆固醇和鞘脂的膜微区，在细胞信号转导和蛋白质运输中发挥重要作用。

产品描述

本品是偶联上红色荧光素-CF568（Ex/Em=562/583 nm）的重组霍乱毒素B亚基（rCTB），即Recombinant Cholera Toxin B subunit, CF568-conjugated，简写：CF568 conjugated- rCTB，适用于神经学研究中的束路追踪，靶向神经节苷脂GM1）结合和逆行运输。也可在活细胞或固定细胞成像中用作脂筏标记物和内吞示踪剂。

保存与运输方法

保存：-20℃保存，至少6个月有效。

运输：冰袋运输。

注意事项

1） 本品以冻干粉形式提供，由于量比较少，初次使用前需置于室温回温至少30min，低速离心后，再开盖直接往瓶内加入合适的溶剂进行溶解。

2） CF系列荧光染料是Biotium的注册商标，Alexa Fluor和DyLight系列染料是Thermo Fisher的注册商标，Cy系列染料是Cytiva的注册商标。

3） 本品仅供科研用途，绝不可以用于临床或诊疗用途。

4） 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法

以下是用荧光标记的rCTB对细胞进行标记的实验流程。对于其他的应用（比如：神经示踪），请根据应用查找相应的文献作为参考。

一、 自行准备材料

1.1 磷酸盐缓冲液（PBS）

1.2 牛血清白蛋白（BSA）

1.3 HBSS

1.4 4%多聚甲全

1.5 【可选】Hoehcst 33342

二、 染料准备

重溶：将低温保存的CF568 conjugated- rCTB（规格：100μg）置于室温回温至少30min，低速离心3-5min，将粉末离心至管底。直接往瓶子加入100μl无菌水或1×PBS使其充分溶解，即得到1mg/ml的母液。

保存：新鲜制备的CF568 conjugated- rCTB（1mg/ml）置于+4℃避光保存，3个月稳定。亦可根据单次用量分装后，置于-20℃避光保存，6个月稳定，避免反复冻融。

三、 活细胞的表面标记

3.1用4℃预冷的HBSS+0.5% BSA清洗细胞一次；

3.2用4℃预冷的HBSS+0.5% BSA稀释CF568 conjugated- rCTB（1mg/ml）到工作浓度：400ng/ml-1μg/ml。

3.3吸走细胞内的缓冲液，加入新鲜配置的CF568 conjugated- rCTB染色工作液。+4℃避光孵育30min。

3.4用4℃预冷的HBSS+0.5% BSA清洗细胞三次；

3.5用4%多聚甲全固定细胞，+4℃避光固定15min。

3.6用PBS清洗细胞二次，之后进行成像或接着做后续的染色。【注：根据实验需求，考虑是否加入核复染剂-Hoechst 33342等】