IFT57 敲除单克隆 ( 293T)

CRISPR 技术进行细胞 TP53 基因敲除

实验原理 TP53 是重要的抑癌基因。在多种肿瘤中都能发现 TP53 基因突变及功能丧失。我们将针对 TP53 基因设计的靶点构建到 pCas9/gRNA1 载体，转染 293T 细胞，构建了 TP53 基因敲除 293T 细胞系。 1、本实验基因敲除原理：pCas9/gRNA1 载体表达 gRNA 和 Cas9 蛋白。将靶点序列克隆到 pCas9/gRNA1 载体上，gRNA 将诱导 Cas9 蛋白对靶点 DNA 进行切割，造成 DNA 断裂。细胞通过邻端连接

【原创】基因组编辑三大工具ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9筛选基因敲除细胞系阳性克隆Protocol

这些方面的进展。关于这些技术的具体原理和操作细节，请查看我之前的帖子附件详细介绍。不清楚的请联系我咨询。此贴主要谈一谈在用这些技术进行癌细胞株阳性细胞克隆筛选的过程中，如何进行阳性克隆筛选，为初次接触这些新技术的研究者提供一些参考意见。一般CRISPER-Cas9质粒转染后，采用有限稀释法接种到96孔板中长克隆，待到单个细胞长到几百到1000个细胞左右时，显微镜下仔细观察每一个孔的细胞，若发现非单克隆的细胞需要将其标注出来剔除筛选之外。传两代后，取出单个克隆的一部分细胞提取基因组DNA。分析敲除位点

慢病毒原来可以这样用！

9 可能促进脱靶效应，这阻碍了其应用于需要高精确度的基因组编辑。而 IDLV 适合递送 Cas9 组分至静息细胞，更适合临床研究，目前已有相关研究成果发表。 作者设计了针对 GFP 的靶点，分别以 LV、IDLV 感染 HEK293T 细胞，在第 7 天提取细胞做全外显子组测序（WES）分析，鉴定出了 16 个基因存在脱靶 4： 载体构建示意图 WES 鉴定脱靶的基因 LV 诱导的插入缺失的频率在 3.4％-24％（深线），而 IDLV 显示出较弱的诱导脱靶插入缺失的能力 0％-6.5％（浅线