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- 纽万生物结合CRISPR/Cas9系统，结合不同细胞类型特性， 为客户提供高效基因敲除解决方案
- 广州
- 2026年01月06日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 提供商：
纽万生物
- 服务名称：
基因敲除KO稳定细胞株构建
- 规格：
T25培养瓶
01 实验介绍
纽万生物应用基于CRISPR-Cas9技术的对基因敲除单构建克隆细胞株，CRISPR-Cas9系统作为革命性的基因编辑工具，已广泛应用于生物医学各领域，不仅推动了基础科学研究的发展，更为疾病模型建立、药物靶点筛选及基因治疗提供了可靠的技术平台。
CRISPR-Cas9系统的核心在于sgRNA引导Cas9蛋白对特定基因序列进行精准识别和切割。CRISPR-Cas9基因敲除系统通过Cas9内切酶切割双链DNA后，触发细胞自身的修复机制，从而实现基因敲除。
02 实验流程
预实验1：对目的细胞进行转导测试：GFP空载质粒电转细胞，确定最佳的电转程序。
预实验2：PCR引物设计和测序验证：在敲除区域前后设计2对PCR引物，提基因组DNA做PCR，确定细胞中DNA序列与数据库序列是否一致。
sgRNA设计与载体构建：针对目标基因序列设计特异性的sgRNA，通常针对每个基因设计3种以上sgRNA，并通过软件分析确保sgRNA没有预测的脱靶结合位点。然后将选择的sgRNA设计克隆到适当的cas9载体中。
质粒转导：利用电转方法，将sgRNA-Cas9载体导入目标细胞，随后使用适当的抗生素（如嘌呤霉素）进行筛选，获得稳定转染的细胞群。
单克隆细胞筛选：基因敲除阳性单克隆细胞株筛选：挑取单克隆，继续培养至细胞足量。
敲除效率验证：提取单克隆细胞的DNA，通过PCR和测序，确定是否为纯合。
03 技术优势
应用范围广：该技术适用于各种类型的细胞，广泛应用于基因功能研究、疾病模型构建及药物开发等领域。
操作相对简便：与传统基因 targeting 技术相比，CRISPR-Cas9系统设计简单、成本较低、周期较短。
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文献和实验用慢病毒筛选稳定细胞株，以G418筛选方法为例，筛选出稳定整合Neomycin抗性基因的细胞系。 A 、 G418 抗生素最优浓度筛选 每种细胞对抗生素的敏感性不同，因此，准备建立稳定细胞系之前，需要确定能够在10-14天杀死细胞的最佳浓度。 方法如下 ： 1、将细胞稀释到1000个细胞/mL，接种到24孔板，每孔1ml。 2、接种后第二天在100ug/mL~1mg/mL的G418浓度范围内进行筛选。3、每隔3天跟换1次培养液，保持G418浓度不变。 4、选择出
之降解，是在 RNA 水平上的降低目的基因的表达。此时，基因敲除稳转株可以很大程度上规避这个问题。因为基因敲除稳转株是在基因组水平上通过基因序列的改变使其基因功能丧失，在敲除细胞中通常不会检测到靶蛋白的表达，而且敲除效果稳定，不能恢复，也就是永久性敲除了。但是基因敲除稳转株缺点是操作周期长，费用多，效率低。如何选择基因下调表达的方式，就要综合考虑了。那么同样是稳定株，单克隆？混合克隆？要怎么选？细胞：当需要去除细胞群体干扰因素的时候，推荐使用单克隆稳定细胞株，其基因组背景相对单一，对实验
细胞中Atg10基因敲除案例M：100 bp-DNA Marker；pool：混合克隆；clone1-18：单克隆；positive：Positive Control DNA 结论：pool（混合克隆）的结果显示，基因敲除的效率约为40%。clone3, 7, 8, 11, 15和17为潜在的阳性克隆，后续直接进行TA克隆进行验证等位基因突变情况。 现在，您是否还在为筛选不到阳性克隆而烦恼，有了这一款产品，相信就可以高效精准地找到KO阳性克隆了。
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