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- 基于标签的蛋白质定量技术-iTRAQ，TMT，SILAC检测技术服务
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北京百泰派克生物科技有限公司
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基于标签的蛋白质定量技术-iTRAQ，TMT，SILAC检测技术服务
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基于标签的蛋白质定量技术-iTRAQ，TMT，SILAC检测技术服务-详情
细胞中蛋白质组丰度的动态变化对各种生命过程都有重要影响。例如，许多疾病的发生和发展通常伴随着某些蛋白质的异常表达。定量蛋白质组学是对一个基因组中表达的所有蛋白质或一个复杂混合系统中的所有蛋白质进行准确的定量和鉴定。目前，定量蛋白质组学技术主要分为标记策略和非标记策略，其中标记策略分为体内标记（如SILAC）和体外标记（如iTRAQ，TMT）。
相对定量和绝对定量等压标签（iTRAQ）
iTRAQ是AB SCIEX公司于2004年开发的一种定量蛋白质组学研究技术。该技术可以比较许多不同样品中的蛋白质。例如，它可以研究不同病理条件或不同发育阶段的组织样品中蛋白质表达水平的差异。同时，iTRAQ可以准确地定量和鉴定一个基因组中表达的所有蛋白质或一个复杂混合系统中的所有蛋白质。iTRAQ可以使用8种不同的同位素试剂同时标记和比较8种不同的蛋白质样品。标记试剂由报告基团，平衡基团和胺特异性反应基团组成。
iTRAQ的工作流程
iTRAQ技术的一般过程如下图所示。简要地说，样品被胰蛋白酶裂解后，被烷基化并酶消化成肽段。用iTRAQ试剂的标记标签对产生的肽段进行差异标记，然后将标记的样品混合在一起进行LC-MS/MS分析。
四种不同样品（S1-S4）多重反应的一般方案，用四种不同的颜色表示（Zieske et al.,2006）
iTRAQ的优势
1. 在一次实验中，iTRAQ可以同时标记4至8个样品。操作简单快捷。适用于多个样品的高通量检测，并且实验设计更加灵活；
2. iTRAQ是在肽段水平上进行的体外标记，适用于许多类型的生物样品；
3. iTRAQ具有重复性好、灵敏度高的特点，可以同时进行定性和定量。
串联质量标签（TMT）
TMT是美国Thermo Fisher Scientific开发的一种肽体外标记技术。该技术zuì多可以使用10个同位素标签来标记多肽的氨基。经过LC-MS/MS分析后，可以同时比较10个不同样品中蛋白质的相对含量。TMT广泛用于疾病标志物筛选、药物作用靶标、动植物抗病或抗逆机制、动植物发育和分化机制等领域。
TMT的工作流程
TMT的一般过程如下图所示。将不同的蛋白质样品变性、还原、烷基化并消化成肽段样品。然后将这些肽段样品用TMT试剂盒标记后合并为一个样品。使用HPRP液相色谱分离合并的样品，并将馏分串联为12个样品。纯化后，通过HPLC-MS分析每个样品。分析数据以获得蛋白质的定性和相对定量信息。
使用10plex TMT进行相对定量的流程（Zhang et al.,2017）
TMT的优势
1. 高灵敏度：可以检测低丰度的蛋白质；
2. 分离能力强：可以分离酸/碱蛋白、小于10KD或大于200KD的蛋白、不溶性蛋白等；
3. 应用范围广：可以鉴定任何类型的蛋白质，包括膜蛋白质、核蛋白质和胞外蛋白质；
4. 高通量：可以同时分析10个样品，特别适合对采用多种处理方法或多种处理时间的样品进行差异蛋白质分析。
细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记（SILAC）
SILAC是用于高通量定量蛋白质组学的有效方案，它是根据依赖于必需氨基酸的哺乳动物细胞增殖的原理设计的。SILAC用于定量蛋白质组学研究，可以分析细胞中的蛋白质相互作用和蛋白质表达差异，为复杂的哺乳动物细胞蛋白质组学的全面系统的定性和定量分析提供有效的解决方案。
SILAC的工作流程
SILAC的一般过程如下图所示。向细胞培养基中添加轻、中或重稳定同位素标记的必需氨基酸（主要是赖氨酸和精氨酸），通过细胞的正常代谢，所有新合成的蛋白质都被标有稳定同位素。等量混合所有类型的蛋白质，通过SDS-PAGE分离、切胶和酶消化后，用LC-MS/MS分析可以获得相关蛋白质的定量和定性结果。
使用SILAC进行蛋白质定量（Esthelle et al.,2019）
SILAC的优势
1. SILAC是一种活细胞水平的标记技术。标记效果稳定有效，标记效率不受裂解液的影响。
2. SILAC需要的样品更少，通常每个样品仅几十微克的蛋白质就足够了。
3. SILAC使用质谱法同时鉴定和定量多种蛋白质。
4. SILAC使用体内标记技术，接近样品的真实状态。
参考文献
1. Zieske Lynn R. A perspective on the use of iTRAQ reagent technology for protein complex and profiling studies. Journal of Experimental Botany, 2006, 57(7):1501-1508.
2. Lichao Zhang, Joshua E. Elias. Relative Protein Quantification Using Tandem Mass Tag Mass Spectrometry. Methods in Molecular Biology, 2017, 1550:185.
3. Esthelle Hoedt, Guoan Zhang, Thomas A. Neubert. Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture (SILAC) for Quantitative Proteomics. Adv Exp Med Biol. 2014, 806:93-106.
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文献和实验1. Zieske Lynn R. A perspective on the use of iTRAQ reagent technology for protein complex and profiling studies. Journal of Experimental Botany, 2006, 57(7):1501-1508.
2. Lichao Zhang, Joshua E. Elias. Relative Protein Quantification Using Tandem Mass Tag Mass Spectrometry. Methods in Molecular Biology, 2017, 1550:185.
3. Esthelle Hoedt, Guoan Zhang, Thomas A. Neubert. Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture (SILAC) for Quantitative Proteomics. Adv Exp Med Biol. 2014, 806:93-106.
共沉淀蛋白互作分析、MRM/PRM定量蛋白组学分析、SILAC/Dimethyl标记定量蛋白组分析、SWATH定量蛋白组学、TMT/iTRAQ/multinotch定量蛋白组学分析。下面介绍两种比较常见的定量蛋白质组学技术。 iTRAQ定量蛋白质组学分析 iTRAQ (isobaric tags for relative and absolute quantitation) 技术是由美国应用生物系统公司ABI研发的一种多肽体外标记技术。该技术采用4种或8种同位素的标签，通过特异性标记多肽的氨基基团，而后进
定量蛋白质组学是蛋白质研究的前沿学科。目前常用的定量蛋白质组学研究技术有荧光差异凝胶电泳（DIGE）、同位素亲和标记（ICAT）等。同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）技术是近年来最新开发的一种新的蛋白质组学定量研究技术。结合非凝胶串联质谱技术，该技术可对复杂样本、细胞器、细胞裂解液等样本进行相对和绝对定量研究，具有较好的定量效果、较高的重复性，并可对多达8种不同样本同时进行定量分析。 蛋白质组学的研究非常复杂，仅仅知道蛋白质的身份并不足以最终确定蛋白质，因为蛋白质
的自动搜索（SPIDER）和PTM鉴定技术整合了PTM和突变表征。 PEAKS可提供各种肽的完整序列，各个氨基酸序列的可信度评分，简单的高通量分析报告，以及其他信息。 PEAKS可以对多个数据库搜索引擎的结果进行比较。PEAKS inChorus会自动将测试结果同其他蛋白质ID搜索引擎（例如Sequest，OMSSA，X!Tandem和Mascot）进行交叉检查，这样可防止肽鉴定结果的假阳性。 PEAKS Q是一种用于蛋白质定量的附加工具，支持标记（ICAT, iTRAQ, SILAC, TMT
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