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2XA8 FastHiFi PCR MasterMix(含染

料) 3kb之内高保真快速扩增首推
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  • ￥345
  • 艾德莱/aidlab
  • PC8202
  • 国产
  • 2025年12月18日
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    • 英文名：

      2XA8 FastHiFi PCR MasterMix

    • 供应商：

      杭州昊鑫生物

    • 规格：

      5ml

    ◆ 试剂盒组成、储存、稳定性:

    组成 PC8201 PC8202
    2 × A8 FastHiFi PCR MasterMix 1ml 5ml
     
    储存：-20 ℃ 保存 2 年。短时间（1 个月内）使用可以置 4 ℃。
     
    制品说明：
    本产品包含 A8 FastHiFi DNA Polymerase、dNTPs 和优化的反应缓冲液，浓度为 2 ×。使用时只需加入模板、引物，并补加 H₂O 至 Mix 终浓度为 1× 即可。A8 来自于基因工程改造的pfu，大大提高了扩增速度、保真性和产量。A8 Mix 是长片段超保速快速扩增的首推产品。本制品含红色示踪染料，不需添加上样缓冲液即可直接上样进行电泳；也可经过纯化处理，以用于酶切、连接、荧光测序等后续操作。PCR 产物为平末端，不需要加 A 头，可直接用艾美捷 pTOPO Blunt 平末端系列载体（货号 CV16、CV17）克隆。
     
    产品特点：
    1. 扩增速度快：延伸速度可以达到 2-4kb/min，是pfu的 4-8 倍。
    2. 扩增产量高：一般 PCR 产物量比传统pfu产量高 50%-100%。
    3. 优异保真性：保真性是Taq的 54 倍以上。一般随机挑一个菌落测序便是正确无突变菌落。
    4. 扩增长度指标和pfu一致，可以完全替代pfu进行快速高保真扩增，但不建议用于pfu无法扩增的长片段。
       
      以复杂基因组 DNA 为模板适合扩增不超过 3kb 左右的产物，以简单基因组、质粒和噬菌体 DNA 为模板适合扩增不超过 6kb 左右的产物。
    建议 PCR 体系设置：
     
    Component 25 μl Reaction 50 μl Reaction Final Concentration
    2×A8 PCR MasterMix 12.5 μl 25 μl 1×
    Forward Primer(10 μM) 0.5 μl 1 μl 0.2 μM
    Reverse Primer(10 μM) 0.5 μl 1 μl 0.2 μM
    Template DNA as required as required -
    ddH₂O up to 25 μl up to 50 μl -
     
    参考模板用量（50 μl 反应体系）：
     
    质粒：0.1-10ng；细菌基因组：10-100ng；人类基因组：50-150ng；cDNA：1-5μl from RT reaction。
     
    建议 PCR 循环条件：
     
    Step Temperature Time Cycle Number
    Initial denaturation 95℃ 3 minutes -
    Denaturation 95℃ 10 seconds 30 cycles
    Annealing 55℃ 10-15 seconds 30 cycles
    Extension 72℃ 15-30 seconds / kb 30 cycles
    Final Extension 72℃ 2-5 minutes -
      4-8℃ Hold -

    注意事项：

    1. A8 扩增速度快，质粒和简单基因组等简单模板可以采用 15-20 秒 /kb，复杂模板如人类基因组可以采用 30-45 秒 /kb。
    2. 对于 GC 含量很高的模板，预变性和变性温度可以提高到 98℃。A8 耐热性强，98℃ 对 A8 的活性无改变。
    3. 如果扩增模板 GC 含量高或者模板复杂扩增效果不佳时，可在反应混合物中加入 DMSO 到终浓度 1%-8%，按照 1% 梯度增加摸索最佳浓度。或者加入甜菜碱至终浓度 1.0-1.7 M。并采用降落 PCR（Touchdown PCR）
    每一批 2 × A8 PCR Mix 出货前必须通过下面的 2 种大小片段的扩增检测：
    产品细节图片1
    Figure.1. Amplification of DNA fragment from 50 ng genomic DNA in 50μl reaction mixture. Lane M: 1kb ladder; Lane 1-2: Poly(A) Polymerase from E. coli gDNA, 1.4Kb, extension 20 sec/kb; Lane3-4: Hα1AT from Human gDNA, 2.6Kb, extension 30 sec/kb. 

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    • 反向PCR(reverse PCR)相关知识

      PCR的主要优点是简单快速，可以研究许多独立克隆。其某些应用适合于临床诊断。 反向PCR的局限之一是由未知边侧序列性质引起的，需用几种酶试验以选择产生 大小合适的片段的内切酶。另一局限是许多常用内切酶也在不适当位点裂解载体序列。但一旦确定合适的内切酶，反向PCR方法是直接了当和可靠的。大多数真核基因组含大量中度或高度重复序列，YAC或科斯粒中未知接点序列有时也包括这些序列。通过反向PCR扩增得到的探针可与许多基因组序列杂交，但它们在用于染色体的步查或跳查方面会受到限制，在这种情况下，需要进行亚克隆。

    • PCR专题

      成为潜在的污染源。如果以含靶序列的重组质粒为对照，100 个拷贝之内的靶序列就足以产生阳性扩增。阴性对照的选择亦要慎重，因为PCR 敏感性极高，可以从其它方法（Sourthern 印迹或点杂交等）检测阴性的标本中检测出极微量的靶分子。此外，每次扩增均应包括PCR 体系中各试剂的时机对照，即包括PCR 反应所需的全部成分，而不加模板DNA，这对监测试剂中PCR 产物残留污染是非常有益的。如果扩增结果中试剂对照为阳性结果，就是某一种或数种试剂被污染了。此时，要全部更换一批新的试剂进行扩增，扩增时设立不同

    • 实时荧光定量 PCR 的原理及应用

      、引物序列不同，Tm 值的差异会很大。引物的熔解温度决定了退火温度。而且模版中碱基的组合千变万化，对于特殊片断，经验公式得到的数据不一定能得出准确的结果，退火温度细微的差异对结果都可能产生决定性的影响，因而「摸条件」一度是让人很头疼的问题。梯度 PCR 的出现部分解决了一些问题——在反应过程中每个孔的温度控制条件可以在指定范围内按照梯度变化，根据结果，一步就可以摸索出最适合的反应条件。 不单退火温度，连变性温度和延伸温度都可以优化——对于多种聚合酶混合酶扩增多数高保真 Taq 酶来说这个非常重要

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