SILAC实验常见问题与解决方案大全

SILAC因其高准确性、低批次误差、原位标记的优势，广泛用于细胞蛋白质组定量、蛋白互作研究以及动态调控机制探索。但不少科研人员在实际操作过程中会遭遇标记效率低、质谱背景高、数据偏离生理状态等问题，导致实验重复、进展延迟甚至数据报废。本文将结合实验实践与质谱数据经验，总结SILAC实验中最常见的问题，并提供实用且可操作的解决方案，为您规避风险、提升成功率。

 

常见问题一：标记效率不达标（<95%）

1、问题描述

使用重氨基酸培养细胞数代后，仍检测到大量“轻”肽段信号，标记效率低于95%，影响后续定量准确性。

 

2、解决方案

 

百泰派克生物科技提供细胞标记效率验证服务，可在实验前中后阶段对肽段轻/重比例进行LC-MS监控，保障数据稳定性。

 

常见问题二：SILAC培养导致细胞状态异常

1、问题描述

转至SILAC培养基后，细胞增殖变慢、状态变差，甚至出现脱落、死亡。

 

2、解决方案

（1）渐进适应：将细胞从普通培养基转至“混合培养基”（普通FBS + dialyzed FBS混用），过渡1~2代；

（2）营养补充：在初期添加必要的营养因子，如非必需氨基酸（NEAA）、葡萄糖增强等；

（3）选择合适细胞系：部分细胞（如部分神经细胞、造血系细胞）对营养变化敏感，可考虑Super-SILAC策略替代；

（4）避免过度传代：标记过程中不宜传代过多 (>10代)，否则可能引入转录组与蛋白组漂移。

 

常见问题三：样本处理造成同位素“交叉污染”

1、问题描述

混合轻/重样本时出现“交叉污染”信号，轻样本中检测到重肽段，或重样本中混入大量轻肽段。

 

2、解决方案

（1）先分别裂解再混合：务必在裂解完成后再混合轻/重样本，避免细胞水平交叉；

（2）操作顺序固定：如先处理轻样本，再处理重样本；或使用单独试剂耗材，避免交叉污染；

（3）使用低吸附离心管：某些肽段在普通塑料管中易吸附，可选择质谱级低吸附耗材；

（4）清洗充分：确保免疫富集或SDS清洗过程充分去除非特异结合物。

 

常见问题四：质谱信号差、背景高、重复性差

1、问题描述

SILAC样本上机后，发现蛋白组覆盖率低，差异蛋白波动大，背景干扰显著。

 

2、解决方案

（1）蛋白提取清洁度差：避免使用含SDS或变性剂的缓冲液，选择适用于MS分析的裂解液；

（2）酶解效率低：优化Trypsin:Lys-C组合酶解策略；建议进行肽段预纯；

（3）MS参数优化不足：选择高分辨率Orbitrap或timsTOF，开启SILAC模式定量优化；

（4）样本混合比例偏差：提前测定蛋白浓度，确保轻/重组1:1等量混合，否则定量比值偏斜；

百泰派克生物科技配备自动化蛋白定量平台与标准化酶解流程，确保样本一致性与质谱信号质量。

 

常见问题五：定量数据偏离真实生物学状态

1、问题描述

SILAC定量结果与qPCR或WB检测的变化趋势不一致，引发质疑。

 

2、解决方案

（1）转录/翻译脱耦现象：蛋白质组反映翻译后的状态，与mRNA水平非一一对应；

（2）稳定性差异：SILAC反映的是“稳态蛋白水平”，若蛋白半衰期长，短时应激处理下变化不明显；

（3）时间点选择不当：应结合预实验确定最佳处理时点；

（4）标记对细胞有扰动：长期标记可能改变基础表达谱，建议引入未标记对照组做背景校正；

 

百泰派克生物科技为您提供的一站式SILAC技术支持

作为专业的蛋白质组学解决方案服务商，百泰派克生物科技可为您提供：

 

• 标记效率评估 + 细胞培养支持
• 标准化蛋白提取/酶解/肽段处理流程
• Orbitrap与timsTOF双平台定量质谱服务
• 差异蛋白筛选 + 通路富集分析 + 可视化报告
• Super-SILAC策略定制，适用于临床样本研究

 

无论您是SILAC初学者，还是在做高级多通道设计，我们都能提供专业的技术支持与数据交付。SILAC是一项高度成熟且科学性极强的定量蛋白组学策略，但前提是每个环节都必须精准执行。避免常见错误，不仅能节省大量试错成本，也能显著提升数据的发表价值与可信度。

 

百泰派克生物科技特色项目

 

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

 

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 100% 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

 

 

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

 

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.专业生物信息学分析，分析更系统准确。

 

 

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，然后用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，最后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

 

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标同时进行表征，百泰派克生物科技可做到同时检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

 

 

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从最小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

 

 

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

 

 

百泰派克生物科技七大检测平台

 

 

 

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物质谱多组学优质服务商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等专业服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

1.公司采用ISO9001质量控制体系，专业提供以质谱为基础的CRO检测分析服务；

2.获国家CNAS实验室认可，为客户提供符合全球药政法规的药物质量研究服务；

3.业务范围覆盖蛋白质组学、多肽组学、代谢组学、生物药物表征、单细胞分析、单细胞质谱流式、生信云分析以及多组学生物质谱整合分析等；

4.七大质量控制检测平台，满足您一站式服务需求；

5.服务3000+企业，10000+客户的选择；

6.致力于为您提供优质的生物质谱分析服务!