YF647 Click-iT EdU 通用款细胞增殖检测试剂

 

产品货号：E6043/E6044/E6045/E6046

储存条件：-20℃避光保存 。 开封后按指定温度保存，可有效放置一年。

 

产品介绍

细胞增殖检测是评估细胞健康程度、遗传毒性及抗肿瘤药物效果的基础实验手段。检测细胞增殖最精确的方法是BrdU法。EdU法检测试剂盒是BrdU法的革命性突破。EdU（5-乙炔基-2’-脱氧尿苷）是一种嘧啶类似物，在DNA合成期整合入DNA双链。EdU法检测基于“点击”反应，一种由铜催化的叠氮化合物和炔烃作用发生共价反应，形成共价键。本试剂盒中，EdU含有炔烃，YF488/555/594/647AAzide染料含有叠氮化合物。点击法的EdU标记增殖快速有效，易于使用。

BrdU方法需要DNA变性（如酸变性、热变性或者用DNase消化）暴露出BrdU，从而方便BrdU抗体结合；而EdU法只需多ju甲醛固定和TritonX-100促渗就可以使检测试剂进入细胞，只需少量的叠氮化染料即可非常有效地标记出整合的EdU。本试剂盒包含EdU法检测所需要的所有组分，可以用于体外培养细胞的增殖检测。

荧光光谱数据：YF488 Azide：495/519nm；YF 555 Azide：555/565nm；YF594 Azide：590/617nm

YF 647A Azide：650/670nm；Hoechst 33342：350/461nm（boundtoDNA）

产品组分

组分	100T	开封后保存温度	开封后按指定温度保存，可有效放置一年
A. 10 mM EdU	200 µL	-20℃
B. YF488/555/594/647Azide	50 µL	-20℃避光
C. 10×Click-iT EdU反应缓冲液	1 mL	2-8℃
D. CuSO4	500 µL	2-8℃
E. Click-iT EdU 缓冲液添加物	30 mg	2-8℃
F. Hoechst 33342	25 µL	2-8℃

规格：如果用于荧光显微镜检测，所能使用次数为上述各个规格的最大使用次数（针对96孔板培养的细胞），如E6043/

E6044/E6045/E6046可检测20个孔的样品（不同容器的具体用量可参考附表1）；如果用于流式检测，所能使用次数为上述各个规格的最小使用次数，如E6043/E6044/E6045/E6046可检测2个样品。

 

使用方法

实验材料（自备）

10 mM PBS, pH 7.2-7.6

4 %多ju甲醛固定液（in PBS）

促渗试剂（0.5 %Triton X-100 in PBS）

2 mg/mL 甘氨酸溶液（in ddH2O） 3 %BSA in PBS, pH 7.2-7.6

1 % BSA in PBS, pH 7.2-7.6

ddH2O

96/24/12/6 孔培养板或培养皿 

 

荧光显微镜检测方法

1.细胞培养

取对数生长期细胞，以每孔4×10³-1×10⁵细胞（可根据细胞大小、生长速度以及实验处理的具体要求调整细胞数量和密度）接种于96孔板中，培养至正常生长阶段。

2.药物处理

根据实验需要进行各种药物处理。

3.EdU标记

（1）用细胞完全培养基按一定比例稀释EdU溶液（组分A）至合适浓度后加入细胞中，混匀；设置不加EdU处理的阴性对照组。

注：EdU的标记浓度需根据细胞类型加以调整，建议以10µM的初始浓度进行摸索。预实验中，建议设置EdU浓度梯度,可参考附表2和附表3。

（2）细胞培养箱中孵育2h。

注：最佳孵育时间与细胞周期有关，大多数肿瘤细胞系均可采用2h的孵育时间，可参考表2。Edu浓度与孵育时间相关，短时间孵育（<2h）宜采用高浓度，如：10~50μM；长时间孵育（>24h）宜采用低浓度，如：1~10μM；也可参考表3。

4.细胞固定及促渗

注：对于需要做细胞表面抗原标记的实验，可以考虑在完成EdU孵育后，以含3%BSA洗涤液洗涤细胞2次，在细胞固定促渗之前进行。

（1）孵育完成后，去除培养基。以1XPBS清洗细胞两次，每次5min，以除去未掺入DNA的EdU残留，贴壁不牢的细胞可降低清洗强度。加入50μL4%多ju甲醛固定液，室温孵育20min后，去除固定液。

（2）每孔加入50μL2mg/mL甘氨酸溶液，室温孵育5min，中和残留的固定液。

（3）以每孔100μL3%BSA洗涤细胞2次。

（4）去除洗涤液，加入100μL0.5%TritonX-100，室温孵育10min。

5.EdU检测

注：本参考步骤每个样本使用100μL的工作液，用户可以根据自己的样本情况调整用量。

（1）配置1×Click-iTEdU反应缓冲液（组分C）：用ddH2O将组分C稀释10倍。

（2）配置5×Click-iTEdU缓冲液添加物（组分E）：加300μL的ddH2O至30mg的E组分管中（终浓度100mg/mL），混匀至全部溶解。使用后，剩余储液存放在-20℃,可保存一年，溶液一旦呈现棕色，则说明有效成分降解不能再用。

注：不同规格的组分E均按照此比例加ddH2O溶解，制备成5×储液备用。

（3）准备1×Click-iTEdU缓冲液添加物：用ddH2O稀释5×Click-iTEdU缓冲液添加物至1×,溶液应现配现用。

（4）依据下表准备 Click-iT 工作液。

反应组分	以10个孔的样本数为例
1×Click-iT EdU反应缓冲液	855 µL
CuSO4（组分D）	40 µL
YF488/555/594/647Azide（组分B）	5 µL
1×Click-iT EdU缓冲液添加物	100 µL
总体积	1 mL

（5）去除促渗剂，每孔100μL的3%BSA洗涤液洗涤2次。

（6）每孔加入100μLClick-iT工作液，均匀覆盖细胞。

（7）室温避光孵育30min。

（8）除去Click-iT工作液，以100μL3%BSA洗涤细胞2次后，去除洗涤液,加入100μLPBS保持细胞湿润。如其他无特别要求，即可进行拍照分析。

6.DNA复染（可选）

（1）用100μLPBS洗涤细胞1次，去除洗涤液。

（2）用PBS将Hoechst 33342（组分F）稀释2000倍。

（3）每孔加100μL1×Hoechst 33342溶液，室温避光孵育15-30min。

（4）去除Hoechst33342溶液，用100μL PBS洗涤细胞2次。

7.成像及分析

建议染色完成后立即进行荧光显微镜拍照观察；如果条件限制，请于4°C条件下避光湿润保存3天之内完成拍照。

 

流式细胞仪检测方法

1.  细胞培养

每孔1×10⁵-3×10⁶细胞接种于 6 孔板中。

2.  药物处理

根据实验需要进行各种药物处理。

3. EdU  标记细胞

（1）用细胞完全培养基按一定比例稀释 EdU溶液（组分 A）至合适浓度后加入细胞中，混匀；设置不加 EdU处理的阴性对照组。

注：EdU 的标记浓度需根据细胞类型加以调整，建议以10 µM的初始浓度进行摸索。预实验中，建议设置 EdU 浓度梯度，

可参考附表 2 和附表 3。

（2）细胞培养箱中孵育 2 h。EdU 孵育细胞的时间可以直接用作测定细胞 DNA  合成的指标，时间点选择以及孵育的时间取决于细胞生长速率。通过短暂的 EdU 孵育进行的脉冲式标记细胞可以用于研究细胞周期动力学。

注：最佳孵育时间与细胞周期有关，大多数肿瘤细胞系均可采用2h的孵育时间，可参考附表2。EdU浓度与孵育时间相关，短时间孵育（<2h）宜采用高浓度，如：10~50μM；长时间孵育（>24h）宜采用低浓度，如：1~10μM；也可参考附表3。

4.细胞固定及促渗

注：对于需要做细胞表面抗原标记的实验，可以考虑在完成EdU孵育后，以含1%BSA洗涤细胞2次，在细胞固定促渗之前进行。

（1）孵育完成后，收集细胞，每管加入1mL PBS清洗细胞，1000rpm离心5min，吸弃上清，以除去未掺入DNA的EdU残留。

（2）每管加入1mL4%多ju甲醛固定液重悬细胞。

（3）室温孵育20min，1000rpm离心5min，吸弃上清。

（4）每管加入1mL 2mg/mL甘氨酸孵育5min，中和残留的固定液，1000rpm离心5min，吸弃上清，每管加入1mLPBS清洗1次，1000 rpm离心5min，吸弃上清。

（5）每管加入1mL0.5%TritonX-100促渗液重悬细胞，室温孵育10min。

5.EdU检测

注：针对6孔板样本可参考每孔1mL的工作液来进行，用户可以根据自己的样本情况调整用量。

（1）配置1×Click-iTEdU反应缓冲液：用ddH2O将组分C稀释10倍。

（2）配置5×Click-iTEdU缓冲液添加物（组分E）：加300µLddH2O至30mg的组分E试管中（终浓度100mg/mL），混匀至全部溶解。使用后，剩余储液存放在-20℃，可保存一年，溶液一旦呈现棕色，则说明有效成分降解不能再用。

注：不同规格的组分E均按照此比例加ddH2O溶解为5×储液备用。

（3）准备1×Click-iTEdU缓冲液添加物：以ddH2O稀释5×Click-iTEdU缓冲液添加物储液至1×,溶液应现配现用。

（4）依据下表准备Click-iT工作液。

反应组分	单次反应所需加液体积
1×Click-iT EdU 反应缓冲液	875 µL
CuSO4 （组分  D）	20 µL
YF 488/555/594/647Azide（组分  B）	5 µL
1× Click-iT EdU 缓冲液添加物	100 µL
总体积	1 mL

（5）1000rpm离5min，吸弃上清，去除促渗剂，每管加入1mL的1%BSA洗涤液洗涤2次，1000rpm离5min，吸弃上清。

（6）每管加入1mLClick-iT工作液，混匀。

（7）室温避光孵育30min。

（8）1000rpm离5min，吸弃染色反应液，每管加入1%BSA洗涤细胞2次，1000rpm离心5min，吸弃上清，用1mL1%BSA再次重悬细胞（重悬细胞的溶液体积可根据细胞的数量加以调整），流式细胞仪检测。

注：如需进行其他标志物检测可参考步骤4。

6.DNA复染（可选）

（1）用100μLPBS洗涤细胞1次，去除洗涤液。

（2）用PBS将Hoechst33342（组分F）稀释2000倍。

（3）每孔加100μL1×Hoechst33342溶液，室温避光孵育15-30min。

（4）去除Hoechst33342溶液，用100μLPBS洗涤细胞2次。

7.细胞内抗原标记（可选步骤）

（1）加入抗体工作液，混匀。

（2）避光条件下，以合适的温度及时间孵育抗体。

8.流式检测及分析:

（1）建议染色完成后立即进行流式检测；如果条件限制，请避光4℃湿润保存待测，但不应超过3天。

（2）检测的细胞数量建议尽量能达到百万级，若细胞数量较少，检测的细胞数量可调整为十万级起始进行实验。对于细胞

得率过少（刚到万级）的情况，可能不利于做流式图，对此可适当减少步骤5（8）中的清洗次数。

注意事项

1.使用前请将产品瞬时离心至管底，再进行后续实验。

2.荧光染料均存在淬灭问题，实验操作时请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。 

3. Click-iT EdU  缓冲液添加物溶液最好现配现用，以保证最佳结果。

4.本品不建议与TUNEL试剂盒同时检测，由于Edu的结构中有-OH存在，会影响TUNEL的反应过程。

 

附录

表1  EdU培养基及染色反应液的参考用量

试剂	96 孔板	48 孔板	24 孔板	12 孔板	6 孔板	137.5px 小皿
EdU 培养基	100µL	150µL	200µL	500µL	1mL	2mL
染色 反应液	100µL	150µL	200µL	500µL	1mL	2mL

 

表2  EdU的参考孵育时间

细胞系	人胚胎 细胞	酵母细 胞	鼠成纤维细胞	人宫颈癌细胞	人胚肾细胞系	人神经细胞
细胞周期	~30min	~3h	~18h	~21h	~25h	~5d
孵育时间	5min	20min	2h	2h	2h	1d

 

表3  文献中 EdU 孵育浓度及时间

PubMed ID	Reference	CellLine	Concentration	Time
18272492	SalicA,et al.PNAS.2008	NIH3T3,Hela	10 nM~10	1h
18521918	CappellaP,etal.CytometryA.2008	HL-60,A2780 ,U2OS	1~10µM	0.5 h
18996411	ChehehasaF,et al.Neurosci Methods.2009	Neurospher es	1~20µM	24 h
19179 371	LimsirichaikulS,et al.NucleicAcids Res.2009	Primary fibroblasts	10µM	1,2,4h
19253396	WarrenM,etal.Dev Dyn.2009	Chick embryos	10µM~2 mM	4h
19647746	YuY,etal.JImmunol ethods.2009	Spleencells	50µM	24 h
19544417	MomcilovicO,et l.StemCells.2009	HumanES cells	10µM	0.5 h
20080700	CinquinO,etal. PNAS.2010	emb-30	1µM	12 h
20025889	HanW,etal.Life Sci.2009	VSMC	50µM	2h
20659 708	HuangC,etal.J Genet Genomics.2010	ESC	50µM	2h
21310713	HuaH,etal.Nucleic AcidsRes.2011	Fission yeaststrains	10µM	3h
20824490	LvL,etal.MolCell Biochem.2011	EJcells	50µM	4h
21248284	YangS,etal.Biol Reprod.2011	GCcells	50µM	2h
21227924	ZhangYW,etal.NucleicAcids Res.2011	U2OS,HT29	30µM	1.5 h
21829621	GuoT,etal.PloS One.2011	HIT-T15	50µM	4h
21980430	ZengT,etal.PloSOne.2011	MCF-10A	25µM	2h
22012572	DingD,etal.Int Orthop.2011	C3H10T1/2	10µM	24h
22000787	ZengW,etal. Biomaterials.2011	EPC	50µM	4h
21913215	XueZ,etal.JCell Biochem.2011	SGC7901	25µM	24h
22016038	PengF,etal.Lasera MedSci.2011	MSC	50µM	2h
21878637	LiD,etal.JBiol Chem.2011	HCC	50µM	2h