Gibson无缝连接试剂盒
| Gibson无缝连接试剂盒是一种混合酶系统，其可将任意方法线性化的载体和与其两端具有重叠区域的一个或多个PCR片段定向重组连接。该方法不依赖于T4 DNA连接酶，不受载体和目的片段的酶切位点限制，可在30分钟内实现PCR片段高效定向无缝克隆至载体的任意位置，从而获得完整的双链DNA分子。该试剂盒使用简单，只需加入合适比例的载体和PCR片段在室温孵育15-30min即可完成片段的连接。 |
优势 |
- 室温孵育即可完成片段的连接,无需50℃。
- 不受载体或插入片段酶切位点限制在任意位置进行无缝克隆
- 不依赖于T4连接酶，高效连接，无碱基缺失
- 可同时高效连接一个或多个PCR片段
- 无需额外的亚克隆，菌检阳性率高达95%
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原理 |
- T5外切酶可从双链DNA5'端切割形成3'突出末端， 从而促进重叠区域的具有互补序列的片段进行退火。
- 高保真DNA聚合酶可使退火的片段向3'端延伸，从而填补片段缺口。
- Taq DNA连接酶可封闭缺刻从而获得完整的双链DNA分子。
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组分 |
| 组分名称 |
10T |
50T |
| 2XGibson Assemble Mix |
50μl |
250μl |
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储存 |
| -20℃可保存2年，-80℃可保存5年，避免反复冻融。 |
检测效果和应用实例 |
| (1). KpnI/HindIII酶切pCold-sumo-M vector获得线性化载体，插入与载体有25nt同源臂的引物扩增Gp32基因（966bp），然后应用2xGiboson Assembly Mix连接线性化载体和Gp32，室温孵育15min，然后取5μl连接产物转化DH5a感受态细胞，涂板过夜后菌检。其中左图为长斑情况对比，A为对照（不加片段）B为实验组（Gp32片段），右图为挑取32个斑进行PCR扩增后电泳，其中阳性检出率为31/32(~97%)。 |
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| (2).PCR 扩增pCold-sumo-M vector获得线性化载体，插入与载体有15nt同源臂的引物扩增Bsu基因（1.4kb），然后应用2xGiboson Assembly Mix连接线性化载体和Bst，室温孵育30min，然后取5μl连接产物转化DH5a感受态细胞，涂板过夜后菌检。其中左图为长斑情况对比，A为对照（不加片段）B为实验组（Bsu片段），右图为挑取40个斑进行PCR扩增后电泳，其中阳性检出率为40/40(~100%)。 |
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| (3).以单片段连接为例，载体与片段不同摩尔比对连接效率的影响。载体2742bp，片段2439bp，使用载体与片段摩尔比分别为2:1;1:1;1:2;1:3;1:4;1:5 室温连接30min；片段5’和3’端与载体同源序列大小都为17bp，使用通用引物菌检，阳性条带应为2598bp。 结果表明：载体与连接片段选用不同摩尔比对于菌斑数和菌检阳性率的影响较大，综合推荐摩尔比1:5。图中1-6代表载体与片段摩尔比分别为2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5。 |
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| (4).以单片段连接为例，不同的载体量对连接效率的影响。载体2742bp，片段2439bp，使用载体与片段摩尔比为1:5，载体用量分别为0.001pmol、0.005pmol、0.01pmol和0.015pmol室温连接30min；片段5’和3’端与载体同源序列大小都为17bp，使用通用引物菌检，阳性条带应为2598bp。 结果表明：载体用量在0.01~0.015pmol之间，菌斑数和菌检阳性率较高。图中1-4分别代表载体用量为0.001pmol、0.005pmol、0.01pmol和0.015pmol。 |
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(5).多片段连接
单片段连接：载体长2742bp，片段1长2439bp，使用载体与片段摩尔比为1:5，载体用0.01pmol，室温连接30min，片段5’和3’端与载体同源序列大小都为17bp，使用通用引物菌检，阳性条带应为2598bp。
双片段连接：片段2长654bp， 片段3长1802bp，载体长2742bp，载体与片段摩尔比为1:5（片段2和3皆为0.05pmol），载体用0.01pmol，室温连接30min，各片段之间的同源序列长度皆为17bp，通用引物菌检阳性条带为2598bp。
三片段连接：片段2长654bp， 片段4长822bp，片段5长997bp，载体长2742bp，载体与片段摩尔比为1:5（片段2、4和5皆为0.05pmol），载体用0.01pmol，室温连接30min，各片段之间的同源序列长度皆为17bp，通用引物菌检阳性条带为2598bp。
图中1-3分别为单片段、双片段和三片段连接，A-E为PCR扩增连接所需片段，分别为片段2：654bp，片段1：2439bp，片段3：1802bp，片段5：997bp，片段4：822bp， 结果表明：单片段连接的效率显著高于双片段和三片段连接，在进行双片段和三片段连接时，阳性菌检率在50%左右，可多挑取菌斑进行菌检。 |
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