Cytiva 17135501 HiTrap Phenyl

一、产品概述

HiTrap Phenyl FF（High Sub）预填充了 Phenyl Sepharose 6 FF 填料层析柱，用于疏水层析 (HIC)。层析柱用于小规模蛋白纯化以及结合和洗脱条件的筛选。
•提供便捷和快速的小规模蛋白纯化。
•Phenyl Sepharose 6 FF 填料是一种广泛应用的标准芳香族疏水层析填料，用于需要较低填料疏水性的捕获和中度纯化。•Phenyl Sepharose 6 FF 填料两个水平的取代有助于找到最佳选择性及结合载量。
•灵活设计用于与注射器、单一实验室蠕动泵或层析系统（如 ÄKTA 设计）配合使用。
•具有高流速和高载量。
•通过串联连接若干 HiTrap 层析柱或使用 HiPrep 层析柱，可以实现性能优异且便捷的规模扩大。

二、产品特性

1.高取代度配基：苯基配基密度高，增强与目标分子的疏水相互作用，提高分离选择性和结合容量，尤其适用于疏水性较弱的生物分子分离。
2.预装柱设计：即开即用，无需手动装柱，减少操作误差，确保实验重复性；柱床高度5 cm，内径0.7 cm，适配大多数层析系统（如ÄKTA系列）。
3.优质基质：基于Sepharose Fast Flow高流速琼脂糖基质，化学稳定性高，兼容广泛的pH范围（2-12）和常用缓冲液（如磷酸盐、 Tris、醋酸盐等），耐高压（最高0.3 MPa），适合快速纯化流程。
4.优化的分离性能：疏水作用力适中，可通过调节盐浓度（如(NH₄)₂SO₄、NaCl）实现目标分子的线性梯度或阶跃洗脱，分辨率高，峰形对称，减少样品损失。

三、应用范围

•重组蛋白、天然蛋白的捕获与中度纯化
•抗体片段、酶的分离与浓缩
•蛋白质复合物的纯化与表征
•样品脱盐后杂质去除（如核酸、脂类）
•疏水相互作用色谱（HIC）的工艺优化与方法开发

四、储存与稳定性

•将平衡好的HiTrap HIC色谱柱储存于5-10 CV 20%乙醇中，推荐储存温度为4°C至30°C。
•未开封产品保质期为24个月（自生产批号）；开封后建议1个月内使用完毕，使用后需用20%乙醇冲洗并冷藏保存，防止微生物污染。

五、详细操作

（1）缓冲液制备
水和化学品必须是高纯度的。对于高盐浓度的缓冲液，如硫酸铵，使用高质量的盐以防止基线漂移。

（2）推荐缓冲液
1.结合缓冲液：50 mM磷酸钠、1.5 M硫酸铵、pH 7.0
2.洗脱缓冲液：50 mM磷酸钠，pH 7.0

（3）样品制备
由于吸附是在高盐浓度下进行的，因此需要根据结合缓冲液（高盐缓冲液）的pH和离子强度调整样品组成，以获得
一致且可重复的结果。如有可能，将样品溶解于结合缓冲液中。对于离子强度高达~ 1.5 M的情况，可使用HiPrep™26/10脱盐柱、HiTrap脱盐柱或PD-10柱进行缓冲液交换（在更高离子强度下，脱盐柱中的树脂可能发生收缩）。
增加离子强度的另一种方法是：
1.添加固体盐（注意：由于局部盐浓度较高，可能会发生蛋白质沉淀。）
2.添加盐作为高浓度贮备液
3.用结合缓冲液稀释样品，随后调节pH样品必须完全溶解。我们建议在上柱前立即离心或过滤以去除颗粒物质(0.45μm滤器）。切勿将浑浊溶液上柱。浑浊表明样品不溶，可能是由于离子强度不正确所致。当样品粘度过高时，会导致反压过高、样品区不稳定，并形成不规则的流动模式，从而降低检测分辨率。反压过高还可能损坏色谱柱填料。建议的最大样品粘度对应蛋白质浓度为在水溶液中使用50 mg/mL。如果样品中含有脂质或其他高度疏水性物质，它们可能会与HIC色谱柱发生强烈相互作用，导致容量降低且极难去除。在这种情况下，使用稍微低一些疏水性的色谱柱作为预柱会非常有效。应选择能够结合最疏水性物质的预柱，并确保目标物质在初始条件下顺利通过。

（4）色谱柱平衡步骤操作
1.向注射器或泵管中注入洗脱缓冲液（低盐缓冲液）。移除塞子。为避免将空气引入色谱柱，将色谱柱滴定管连接至注射器（通过鲁尔接头）或泵管。
2.拆下立柱出口处的卡扣护罩。
3.用1 mL/min的流速，用5个柱体积（CV）的洗脱缓冲液洗涤色谱柱。
4.用5至10 CV结合缓冲液（高盐缓冲液）洗涤。如果色谱柱中存在空气，则用缓冲液洗涤，直至空气消失。
注意：如果使用P1泵，则可在装有Sepharose高性能树脂的HiTrap 1 mL色谱柱上运行最大流速为1至3mL/min的流速。

（5）用线性下降梯度进行洗脱
盐浓度的线性降低是疏水相互作用色谱中最常用的洗脱类型。连续梯度可以通过不同方式制备，具体取决于可用设备：
• 蠕动泵和梯度混合器
• 单泵或双泵系统
步骤操作
1.平衡色谱柱（参见第19页“ 色谱柱平衡”）。
2.将样品调节至所选的初始pH和离子强度（参见第17页的样品制备 )。
3.涂抹样本。
4.用5至10 CV结合缓冲液洗涤，直至流出液的UV曲线恢复至接近基线。
5 启动梯度洗脱。梯度体积为10至20 CV通常就足够了。
6 用5 CV蒸馏水洗涤，然后用5 CV结合缓冲液重新生成该色谱柱。
色谱柱现在可以用于新的样品。避免将色谱柱或色谱系统储存在高盐缓冲液中，以防止设备内结晶堆积。

（6）采用梯度逐步降低的洗脱法
梯度洗脱法是通过使用不同离子强度的同种缓冲液进行分步操作的技术手段。该方法操作简便快捷，特别适合注射器操作场景，常用于样品浓缩和净化处理。其峰体积较小，分离效果取决于各步骤间洗脱强度的差异。当采用逐步洗脱法时，必须牢记在洗脱峰后过早进行后续步骤时出现人为峰的危险。因此建议首先采用连续梯度洗脱来表征样品及其色谱行为。

六、结合能力测定

可应用于色谱柱的样品量取决于色谱柱的容量及所需分离度。容量取决于样品组成、所选初始条件（如pH值、离子强度、缓冲盐）以及吸附操作的流速。动态容量可通过使用实际样品进行前沿分析来确定：
步骤操作
1.平衡色谱柱，参见第19页 “色谱柱平衡”。
2.将样品调节至所选的初始pH和离子浓度强度，参见第17页的样品制备 。
3.通过UV、PAGE、ELISA或其他适当技术测定样品中实际蛋白质的浓度。
4.用纯化方法中使用的流速，用泵或注射器将样品施加到色谱柱上。收集馏分并继续施加样品，直至色谱柱饱和。
5.用5至10 CV结合缓冲液洗涤色谱柱，直至基线稳定。
6.用2至5 CV洗脱缓冲液（低盐缓冲液）洗脱结合蛋白，并收集洗脱液。
7.分析步骤4和步骤6中待测蛋白质的组分和洗脱液，并确定突破曲线。实际容量是在不发生突破的情况下可使用的量，而总容量可通过分析步骤6的洗脱液来确定。

七、清洁和再生

HIC吸附剂通常可通过用蒸馏水洗涤来再生。为了防止污染物在色谱柱上逐渐堆积，建议定期清洗。沉淀的蛋白质可通过用5 CV 0.5至1.0 M的NaOH洗涤，随后以1 mL/min的流速用5至10 CV水冲洗来去除。强结合物质可通过用5至10 CV浓度高达70%的乙醇或30%异丙醇洗涤来去除。