Cytiva 17044001 Con A Sepharos

一、产品描述
偶联有刀豆蛋白A的Con A Sepharose 4B是一种亲和层析填料，用于捕获糖基化生物分子，包括糖蛋白和糖脂。对α-D-葡萄糖的亲和力高于α-D-甘露糖。
•刀豆蛋白A（Con A）可结合含有α-D-甘露糖、α-D-葡萄糖和与其空间位置相关的基团（具有可用的C-3、C-4 或 C-5 羟基）。
•用于含糖分子的基团特异性吸附剂。
•非常适用于从去垢剂溶解的膜中分离细胞表面糖蛋白。
•Con A通过HBr活化偶联至 Sepharose 4B。
Con A Sepharose是刀豆蛋白A与 Sepharose 4B 通过HBr方法偶联而成。刀豆蛋白A（Con A）是从洋刀豆（刀豆）中分离得到的一种四聚体金属蛋白。Con A可与含有α-D-吡喃甘露糖基、α-D-吡喃葡糖基以及与其空间位置相关的分子基团结合。此类糖需含有C-3、C-4和C-5羟基才能与Con A 反应。与琼脂糖凝胶偶联的Con A通常用于糖蛋白、多糖和糖脂的分离和纯化。

二、主要特性
1.高特异性：Con A 对 α-D-甘露糖/葡萄糖残基的专一性结合能力，确保目标糖分子的高效捕获。
2.高载量：每毫升介质可结合约 12–18 mg 人 IgG（典型糖蛋白），满足大规模纯化需求。
3.化学稳定性：基质耐受常见缓冲液（如 PBS、Tris-HCl）、低盐及温和去污剂（如 0.1% Triton X-100），可兼容多种洗脱条件（如甲基 α-D-甘露糖苷竞争洗脱）。
4.物理稳定性：刚性基质减少操作中的压缩现象，适合重力流、低压层析系统（如 ÄKTA™ 系列）。
5.批次一致性：严格的生产质控确保各批次性能稳定，实验重复性高。

三、产品规格

四、应用领域
•糖蛋白（如抗体、酶、受体）的分离与纯化；
•糖肽、多糖的富集与分析；
•细胞膜蛋白、病毒颗粒等含糖基结构生物分子的纯化；
•免疫沉淀、受体-配体相互作用研究。

五、储存与稳定性
•储存条件：2~8°C 密封避光保存，不可冷冻。
•保存液：20%乙醇（防止微生物污染）。
•稳定性：在推荐条件下可稳定保存2年，开封后建议3个月内使用完毕。

六、使用方法
（1）试剂与材料准备
1.平衡缓冲液：根据实验需求选择合适缓冲液（如含0.15 M NaCl的20 mM Tris-HCl，pH 7.4，或PBS缓冲液），需含1 mM Ca²⁺和1 mM Mn²⁺（金属离子是Con A与糖蛋白结合的必要条件，需提前加入并混匀）。
2.洗脱缓冲液：
•温和洗脱：含0.2~0.5 M α-甲基-D-甘露糖苷（α-MM）或α-甲基-D-葡萄糖苷的平衡缓冲液（浓度需根据目标蛋白结合强度优化，起始建议0.2 M）。
•强洗脱：若温和洗脱不完全，可使用含1 M NaCl或pH 2.5~3.0的酸性缓冲液（如0.1 M glycine-HCl），但需注意对蛋白活性的影响。
3.再生缓冲液：含0.5 M NaCl和0.1 M NaOH的水溶液（用于去除强结合杂质）。
4.其他：层析柱（推荐柱体积10~20mL，根据样品量调整）、蠕动泵或层析系统、离心机（4°C，500 × g）、0.45μm滤膜（过滤缓冲液）。
（2）预装柱准备（若为干粉预装柱，需先溶胀与平衡）
1.溶胀（干粉型）：若产品为干粉，向100 mL干粉中加入500mL平衡缓冲液，室温搅拌2~4小时或4°C过夜，避免剧烈搅拌以防凝胶破碎。
2.洗涤与平衡：
•将溶胀后的凝胶悬液转移至层析柱，打开柱底出口，自然沉降形成床层（床体积约100 mL）。
•用5~10倍柱体积（CV）的平衡缓冲液以1~2mL/min流速洗涤，直至流出液pH与缓冲液一致（可用pH试纸或pH计检测），确保柱床稳定且无气泡。

（3）样品预处理
1.样品准备：目标样品（如细胞裂解液、血清）需用平衡缓冲液稀释至合适浓度（总蛋白浓度建议<10 mg/mL），并补充1mM Ca²⁺和1mM Mn²⁺（若缓冲液中未含）。
2.澄清：4°C，500 × g离心10分钟，取上清；用0.45μm滤膜过滤，去除沉淀和颗粒物，避免堵塞层析柱。
3.预平衡：样品经0.22μm滤膜过滤后，用平衡缓冲液预平衡至与柱平衡条件一致（pH 7.0–7.5，含Ca²⁺、Mn²⁺）。

（4）上样与结合
1.上样：将预处理后的样品以0.5–1 mL/min流速缓慢上样，确保样品与凝胶充分接触（可循环上样1–2次以提高结合效率）。
2.洗涤未结合物质：上样完成后，用5–10 CV平衡缓冲液以1–2 mL/min流速洗涤，直至流出液在280 nm处吸光度（A280）降至基线（<0.01 AU），去除非特异性结合杂质。

（5）目标蛋白洗脱
1.温和洗脱：加入5–10 CV含0.2 M α-MM的洗脱缓冲液，以0.5~1 mL/min流速洗脱，分管收集流出液（每管5~10 mL），监测A280吸收峰，合并含目标蛋白的洗脱峰组分。
2.强洗脱（若温和洗脱不完全）：若A280峰未完全洗脱，用2~3 CV含1 M α-MM或酸性缓冲液洗脱，收集后立即用1 M Tris-HCl（pH 8.0）中和酸性洗脱液至中性，避免蛋白变性。

（6）柱再生与保存
1.再生：
•先用5 CV平衡缓冲液洗涤，去除残留洗脱剂；
•用2–3 CV再生缓冲液（0.5 M NaCl + 0.1 M NaOH）以1 mL/min流速洗涤，去除强结合杂质；
•再用10 CV平衡缓冲液洗涤，恢复柱床至平衡状态，备用。
2.短期保存（1周内）：柱内充满平衡缓冲液，4°C密封保存，避免冻结。
3.长期保存（>1周）：用2–3 CV含20%乙醇的平衡缓冲液洗涤，4°C密封保存，防止微生物污染。

（7）关键注意事项
1.金属离子依赖：Con A与糖蛋白结合需Ca²⁺和Mn²⁺，缓冲液中缺失会导致结合效率下降，需严格控制离子浓度。
2.流速控制：所有步骤流速不宜过快（建议<2 mL/min），确保配体与目标蛋白充分结合与洗脱。
3凝胶保护：避免剧烈搅拌、冻融或干燥，防止凝胶颗粒破碎影响柱效。
4.洗脱剂选择：α-MM比葡萄糖洗脱能力更强，若目标蛋白结合较弱，可降低α-MM浓度至0.1 M以提高特异性。

（8）结果验证
收集的洗脱组分需通过SDS-PAGE、Western blot或活性测定验证目标蛋白纯度与活性，根据结果优化洗脱条件（如α-MM浓度、流速）。
注：具体操作需结合实验目标调整，建议首次使用前参考产品说明书（Cytiva 17044001）及相关文献优化参数。

七、质量控制
每批次检测指标包括：结合载量（人IgG 结合力）、流速特性、pH 稳定性、无菌性及内毒素水平（< 0.1 EU/mL）。