肝片吸虫（FH）核酸检测试剂盒（探针法荧光PCR）

肝片吸虫（FH）核酸检测试剂盒（探针法荧光PCR）
英文名称：Fasciola hepatica Detection Kit 
肝片吸虫属于吸虫纲片形科的 1 种寄生虫。除侵害牛、羊外，也可感染马、驴、驼、狗、猫、猪、兔、鹿以及多种野生动物和人。中国各地广泛存在。虫体扁平叶状，长 20～25 毫米，宽 8～13 毫米。口吸盘位于体前端， 腹吸盘位于前端腹面，口孔开口于口吸盘。肝片吸虫幼虫期在螺体内进行大量的无性繁殖，然后大量逸出。肝片吸虫幼虫期穿破肝表膜，引起肝损伤和出血。虫体的刺激使胆管壁增生，可造成胆管阻塞、肝实质变性、黄疸等。    分泌毒素具有溶血作用。肝片吸虫摄取宿主的养分，引起营养状况恶化，幼畜发育受阻，肥育度与泌乳量下降， 危害很大。 本试剂盒适用于粪便样本和组织样本，用于肝片吸虫感染的辅助诊断。

本试剂盒采对肝片吸虫基因组设计特异性的引物和探针，用荧光 PCR 技术对肝片吸虫的 DNA 进行体外扩增检测，用于对可疑感染病料的病原学检测。

肝片吸虫（FH）核酸检测试剂盒（探针法荧光PCR）试剂组成：

包装规格	25T/盒	50T/盒
FH 反应液	500μL×1 管	500μL×2 管
酶液	25μL×1 管	50μL×1 管
FH 阳性质控品	250μL ×1 管	250μL ×1 管
阴性质控品	250μL ×1 管	250μL ×1 管

说明：不同批号的试剂盒组分不可交互使用

储存条件及有效期：-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次，有效期 12 个月。

适用仪器：ABI7500、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。

标本采集：粪便样品：采集疑似患病的动物粪便样品 10 g 。组织样品：采集动物肝脏内的可疑虫体片段组织。

保存和运输：采集或处理好的样品在 2℃~8℃条件下保存应不超过 24 h；若需长期保存，应放置-70℃以下保存，冻融不超过 3 次。

使用方法：
1.    样品处理和核酸提取（样本处理区） 1.1    样本前处理 组织样品：将动物肝脏内发现的可疑虫体片段组织先用 PBS 液反复冲洗，再用双蒸水冲洗 2~3 次,取 25 mg 样品剪碎。加 500μL PBS 液进行研磨，上清即为待提取核酸的样品。 粪便样品：粪便样品中加水适量，搅拌均匀制成混悬液，用金属筛或纱布过滤，去除粪渣，过滤液静置 15min 或 3000r/min 离心 10min，倾去上清液，可如此反复操作，直至上清液较为透明，最后弃去上层液体。加入 250μL 灭菌 ddH2O 中，95℃煮沸 10 min，上清即为待提取核酸的样品。 1.2    核酸提取 推荐采用公司生产的核酸提取或纯化试剂（磁珠法或离心柱法）进行核酸提取，请   按照试剂说明书进行操作。 2.    试剂配制（试剂准备区） 根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；反应管数每满 10 份，多配制 1 份），每测试反应体系配制如下表： 试剂    FH 反应液    酶液 用量    19μL    1μL 将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中，20μL/管。 3.    加样（样本处理区）   将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 5μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。 4.    PCR 扩增（核酸扩增区） 4.1    将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内； 4.2    设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL； 荧光通道选择： 检测通道（Reporter Dye）FAM， 淬灭通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列仪器请勿选择 ROX 参比荧光，选择 None 即可。 4.3    推荐循环参数设置： 步骤    循环数    温度    时间    收集荧光信号 1    1 cycle    95℃    2min    否 2    45 cycles    95℃    15sec    否         60℃    30sec    是 5.    结果分析判定 5.1    结果分析条件设定（请参照各仪器使用说明书进行设置，以分析 ABI7500 仪器为例） 反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节 Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值（用户可根据实际情况自行调整，Start 值可设在 3～15、End 值可设在 5～20，使阈值线位于扩增曲线指数器，阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线），点击 Analyze 自动获得分析结果。 5.2    结果判断 阳性：检测通道 Ct 值≤40，且曲线有明显的指数增长曲线； 阴性：样本检测结果无 Ct 值，且无特异性扩增曲线； 可疑：样本检测结果 40＜Ct 值≤45，建议重复检测，如果检测通道仍为 40
注意事项
1.    所有操作严格按照说明书进行；
2.    试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完全混匀并短暂离心；
3.    反应液应避光保存；
4.    反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；
5.    使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；
6.    样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；
7.    实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；
8.    试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。

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