禽传染性法氏囊炎病毒（IBDV）核酸检测试剂盒（探针法荧光P

禽传染性法氏囊炎病毒（IBDV）核酸检测试剂盒（探针法荧光PCR）
英文名称：Diagnostic Kit for Infectious Bursal Disease Virus RNA
本试剂盒适用于检测的消化道组织、取排泄物、全血等标本中禽传染性法氏囊炎病毒 RNA，适用于禽传染性法氏囊炎病毒感染的辅助诊断。其检测结果仅供参考。

本试剂盒用一对禽传染性法氏囊炎病毒特异性引物，结合一条特异性荧光探针，用一步法荧光 RT-PCR 技术对禽传染性法氏囊炎病毒 RNA 进行体外扩增检测，用于对可疑感染病料的病原学检测。

禽传染性法氏囊炎病毒（IBDV）核酸检测试剂盒（探针法荧光PCR）试剂组成：

包装规格	50T/盒
IBDV 反应液	500μL×2 管
酶液	50μL×1 管
IBDV 阳性质控品	50μL ×1 管
阴性质控品	250μL ×1 管

说明：不同批号的试剂盒组分不可交互使用

储存条件及有效期：-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次，有效期 12 个月。

适用仪器：ABI7500、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。

标本采集：病死或扑杀禽，取消化道组织；待检活禽，取排泄物，放于 1mL50%甘油生理盐水中，用注射器取血 5mL。

保存和运输：采集或处理好的样品在 2℃~8℃条件下保存应不超过 24 h；若需长期保存，应放置-70℃以下保存，冻融不超过 3 次。

使用方法：
1.    样品处理（样本处理区）
1.1    样本前处理 组织：分别从 3 个不同位置取样，称取样品约 1g，用手术剪剪碎混匀，再称取 0.5g 于研磨器中研磨，加入1.5mL 生理盐水继续研磨，待匀浆后转至 1.5mL 灭菌离心管中，8000rpm 离心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 灭菌离心管中；排泄物：取 0.5g 于 1.5mL 灭菌离心管中，加入 1mL 生理盐水涡旋振荡，8000rpm 离心 2min， 取上清液 100μL 于 1.5mL 灭菌离心管中。
1.2    核酸提取 推荐采用公司生产的核酸提取试剂（离心柱法）进行核酸提取，请按照试剂说明    书进行操作。
2.    试剂配制（试剂准备区） 根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；反应管数每满 10 份，多配制 1 份)，每测试反应体系配制如下表： 试剂    IBDV 反应液    酶液 用量    19μL    1μL 将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中，20μL/管。
3.    加样（样本处理区） 将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 5μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀， 短暂离心。
4.    PCR 扩增（核酸扩增区）
4.1    将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；
4.2    设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL； 荧光通道选择：检测通道（ReporterDye）FAM，淬灭通道（QuencherDye）NONE，ABI 系列仪器请勿选择 ROX 参比荧光，选择 None 即可。  
4.3    推荐循环参数设置： 步骤    循环数    温度    时间    收集荧光信号 1    1 cycle    50℃    10min    否 2    1 cycle    95℃    2min    否 3    45 cycles    95℃    15sec    否         60℃    30sec    是
5.    结果分析判定
5.1    结果分析条件设定（请参照各仪器使用说明书进行设置，以分析 ABI7500 仪器为例） 反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节 Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值（用户可根据实际情况自行调整，Start 值可设在 3～15、End 值可设在 5～20，使阈值线位于扩增曲线指数期，阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线），点击 Analyze 自动获得分析结果。
5.2    结果判断 阳性：检测通道 Ct 值≤40，且曲线有明显的指数增长曲线； 阴性：样本检测结果 Ct 值>40 或无 Ct 值。
5.3    质控标准 阴性质控品：无特异性扩增曲线或无 Ct 值显示； 阳性质控品：扩增曲线有明显指数增长期，且 Ct 值≤32； 以上条件应同时满足，否则实验视为无效。
6.    检测方法的局限性
1.    样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；
2.    样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；
3.    阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；
4.    病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；
5.    不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；
6.    试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；
7.    本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。
注意事项
1.    所有操作严格按照说明书进行；
2.    试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完全混匀并短暂离心；
3.    反应液应避光保存；
4.    反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；
5.    使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；
6.    样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；
7 实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；
8.试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。

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