末端转移酶，AB64540-1000U

TUNEL 检测细胞凋亡原则及经验总结

一、TUNEL法的实验原理 细胞发生凋亡时, 染色体DNA双链或单链断裂产生大量的粘性3'-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3'-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL)。由于正常的或正在增殖

TIL （肿瘤浸润淋巴细胞）细胞的培养

） ● 培养液：RPMI1640 培养液＋10％AB 型血清＋IL－2（200u/ml）或X－VIVO15 培养液 ● 消化液：IV 型胶原酶（230u/g）、I 型DNA 酶3600u 、V 型透明质酸酶（1500u/g） ● 器皿与仪器：75cm2 培养瓶，15ml 聚丙烯试管，手术刀、剪、镊，CO 2 孵箱，三角烧瓶，磁力搅拌器等 实验操作 1.在无菌条件下将切除新鲜瘤体组织去除坏死部分与结缔组织，用RPMI1640 培养液冲洗干净

DNA片断化检测

细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩， 染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂， 形成50~300kbp长的DNA大片段， 或180~200bp整数倍的寡核苷酸片段， 在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱（DNA ladder）。细胞经处理后，采用常规方法分离提纯DNA,进行琼脂糖凝胶和溴化乙啶染色，在凋亡细胞群中可观察到典型的DNA ladder.如果细胞量很少，还可在分离提纯DNA后，用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）使DNA标记，然后进行电泳和放射自显影，观察凋亡