StarLighter 探针法 qPCR 预混液（高GC）

StarLighter Probe qPCR Mix (High GC) 是一款适用于探针法 qPCR 的专用预混液。它含有优选的热启动 Taq DNA Polymerase，该酶与模板亲和力更强，再配合针对高 GC 靶标扩增优化的缓冲液，可以有效抑制非特异性扩增，大幅增加 qPCR 扩增效率和灵敏度。试剂盒可在较宽的浓度范围内得到良好的扩增曲线，对靶基因进行准确的定量、定性和 SNP 检测，具有重复性好，可信度高，兼容各种类型的 qPCR 探针的特点。参比染料 ROX 随试剂盒提供。

本产品是一款 2 × 预混液，只需额外加入引物、探针、模板，使用方便，同时兼容快速程序，缩短检测时间。

产品组分

注：请按照推荐的储存温度保存，避免反复冻融。

储存及运输条件

-25 ~ -15℃ 保存，< 0℃ 运输。

产品应用

基因表达分析；

SNP 和等位基因分型；

测序和微阵列结果的验证；

注意事项

1. 使用前请务必确保产品完全融化并充分混匀。
2. 上机前要离心，避免PCR 管内气泡干扰荧光信号。
3. 使用适当的引物设计软件来设计引物和 Taqman 探针，Taqman 探针需位于引物扩增区域内部，避免与引物重叠或形成二级结构。Tm值应比引物高 5 ~ 10℃，确保探针先于引物退火。
4. 确认淬灭基团（如BHQ、TAMRA）和报告基团（如FAM、HEX）匹配仪器检测通道。
5. 根据不同仪器选择适配的ROX。仪器与 ROX 参比染料对照表：

实验流程

1. 反应体系配制
   • 配制前，确保所有组分充分混匀；
   • 按照下表配制反应体系：

qPCR 标准程序

1. a.预变性时间设置在30 sec ~ 5 min，若模板 GC 含量较高可适当延长预变性时间至 5 min。
2. b.变性时间：标准程序选择10 sec，快速程序可以选择3 ~10 sec。
3. c.退火/延伸温度需要依据引物和探针Tm 值确定，一般 50 ~ 65℃，初次可使用 60℃ 做预实验。
4. d.退火/延伸时间根据扩增片段长度可在20 ~ 45 sec 之间调整。

常见问题与解决方案

1. 扩增曲线异常的原因及解决办法是什么？

答：①如果扩增曲线不光滑，则需要重新校正系统，提高模板浓度，检查 ROX 是否使用错误。

②如果扩增曲线出现断裂或下滑，则可能是模板浓度过高或基线选取范围不当导致，可以降低模板或重新设置基线。

③如果个别扩增曲线骤降，则可能是反应管有气泡，所以上机前应先离心。

2. 如果反应结束无扩增曲线怎么办？

答：①可能是循环数不够：一般设 40 个循环，但过多循环数会增加背景信号，降低数据可信度。

②确认程序中是否设置信号采集：两步法一般在退火/延伸阶段采集信号；三步法在延伸阶段采集信号。

③引物降解：PAGE 检测排除其降解的可能性。

④模板浓度太低：减少稀释度重复实验，先从高浓度做起。

⑤模板降解：重新制备模板。

3. Ct值太高怎么办？

答：①扩增效率低：优化反应条件，尝试三步法扩增或重新设计合成引物。

②模板浓度低：减少模板稀释度，先从高浓度做起。

③模板降解：重新制备模板。

④PCR 产物太长：推荐 PCR 产物长度 80 ~ 150 bp。

⑤存在PCR抑制剂：若为模板带入，加大模板稀释倍数或重新制备模板。

4. 阴性对照出现明显扩增怎么办？

答：①反应体系污染：更换新的试剂、水、引物等重复实验；在超净工作台内操作，减少气溶胶污染。

②引物设计不合理：重新设计并合成引物。

5. 标准曲线线性关系不佳怎么办？

答：①加样误差：提高模板稀释倍数，提高加样体积。

②标准品降解：重新制备标准品。

③模板浓度太高：提高模板稀释倍数。

答：①加样体积不一致：使用更好的移液器；将模板做高倍稀释，适当提高加样体积。

②模板浓度太低：模板浓度越低，重复性越差，减少模板稀释度或提高加样体积。