【ExoCoupl表面装载】ExoCoupl外泌体表面修饰生

ExoCoupl ® 外泌体表面修饰生物正交偶联试剂盒，是恩泽康泰开发的基于生物正交反应实现外泌体表面修饰的试剂盒。 首先通过室温生物正交反应在外泌体表面添加活性基团，再通过活性基团与叠氮键（N3）的反应，将与叠氮偶联的小分子/多肽/核酸等有效成分共价结合到外泌体外表面，实现外泌体的表面修饰。叠氮偶联的有效成分合成比较方便，无电性、分子类型等限制，合成后使用本试剂盒即可连接在外泌体表面。 本偶联试剂盒操作便捷，仅需2步共孵育和2步纯化操作，外泌体表面装载效率高可媲美脂锚共孵育，但非特异性吸附更低。

1 、治疗性小分子、小核酸、多肽等有效成分的外泌体装载； 2 、提高外泌体靶向性的靶向肽表面装载，比如脑神经靶向肽RVG、缺血心肌靶向肽IMTP、泛癌或炎性细胞靶向肽iRGD等。

1 、 操作便捷，仅需2步共孵育和2步纯化操作，即可完成外泌体表面装载 ；

2 、 外泌体表面装载效率高，比如对于靶向肽外泌体表面装载，本试剂盒装载阳性率可媲美脂锚共孵育 。 3、本试剂盒采用2步法标记的方式，负载目的分子 非特异性吸附更低，背景噪音更低。 4、本试剂盒不限制负载的目的分子种类，用户自备的N3标记的小分子、多肽、核酸均可以，且合成便捷，当然目的分子小于4KD负载效率更高，为了方便测定载量建议同时带上N3和FITC/FAM等荧光基团。

首先合成N3和FITC标记的 脑神经靶向肽 RVG（ FITC-RVG-K-N3 ），使用本正交偶联试剂盒（Cat#EC-01-01）对恩泽康泰货架产品293F外泌体（Cat#CTE-06）按照说明书处理，以将RVG靶向肽修饰在外泌体表面。同时，另取一份用 293F外泌体（Cat#CTE-06），使用 RVG脂锚靶向肽（ Cat#EA-06-1 ）将携带FAM荧光的RVG靶向肽同样展示在外泌体表面。 1、负载率对比：通过NanoFCM检测RVG多肽负载阳性率（负载上RVG的外泌体颗粒数/所有外泌体颗粒数）。 如下图所示，结果显示：1）2种方法均可将RVG多肽修饰到外泌体表面，且负载阳性率相当；2）正交偶联试剂盒负载时本底信号更低。

2、将上述2种方法得到的RVG修饰的293F外泌体，脂锚方法得到外泌体命名为“脂锚RVG-外泌体”，正交偶联方法得到外泌体命名为“偶联RVG-外泌体”，未进行RVG修饰的外泌体命名为“对照293F外泌体”，将上述3组外泌体进行红色荧光标记后，分别处理小鼠脑神经瘤细胞Neuro2a细胞和前列腺癌细胞，细胞流式检测细胞对外泌体摄取率。 结果显示：2种方法得到的表面修饰有脑神经元靶向肽RVG的外泌体均可提升 Neuro2a细胞对外泌体的摄取效率；而另外一组不表达RVG受体蛋白的前列腺癌细胞对照，则没有显示出摄取率差异。

注： 1.避免反复冻融。 2.非产品质量问题，不接受退换货。 3.验证数据仅供参考，不作为交付标准。 4. 用户需要自行合成带荧光基团且叠氮键偶联的药物分子，若合成有困难可以联系技术支持为您推荐合成供应商； 5. 建议目的分子的分子量MW不大于4 kD，以得到最佳的偶联效果。若分子量较大，可以在实验步骤5中适当增加投量，初始建议的投量计算方式为MW*10/4000 μl （N3-目的分子-FITC的浓度为1 mg/ml）。 6. 袖珍柱最大上样体积不超过600 μl。 7. 液体溶液使用前请震荡混匀，操作时注意避光。 8. 保质期：1年。

1、 使用多功能酶标仪检测荧光后，如何计算载量？ 将合成的已知浓度(1 000 μ g/ml ) 的N3 -目的分子-FITC溶液作为标准品，取20μl加入180μl 通用缓冲液稀释10倍为100μg/ml，而后依次取100μl加入100μl通用缓冲液中，经2倍倍比稀释为7个浓度梯度标准品各自混匀；外泌体终产物样本使用通用缓冲液稀释约 2-10 倍至 100μl混匀；各浓度标准品和样本均取 80μl 加至 96 孔板，用多功能酶标仪检测荧光强度（激发光 488nm，发射光 515nm-535nm）。 根据标准品的酶标仪检测荧光值和相应浓度（μg/ml），得到标准曲线：y=Ax+D 稀释的外泌体终产物酶标仪检测荧光值：B（EU） 外泌体终产物稀释倍数：n N3 - 目的分子-FITC的 分子量：M（Da） 外泌体终产物总量：BCA 检测浓度为C（μg/ml） 那么，单位外泌体脂锚靶向肽总载量（nmol/mg）=[(B-D)/A] *n/M/C*1000000 2、 负载后的外泌体如何保存？ 为获得最佳结果建议尽可能使用新鲜样本，但由于实验条件的限制，可能无法每次都能使用新鲜样本。为保证阳性颗粒占比建议4℃放置3天内，最多不能超过7天，-20℃放置2周内，样本尽可能避免反复冻融（冷冻前可适量分装）。