【Exosupur®纯化试剂盒】Exosupur外泌体纯化袖

Exosupur ® 外泌体纯化袖珍柱试剂盒在分子筛SEC的基础上增加了多模式吸附功能，用于外泌体的分离纯化时具有纯度高、回收率高、高效除杂、可重复性强、外泌体完整性好、操作简单、对设备要求低等优点，可在45min内完成外泌体的分离纯化。

1. 染色后的外泌体进行游离染料的去除； 2. 荧光抗体标记后的外泌体进行游离荧光抗体的去除； 3. 外泌体负载小分子后游离小分子的去除； 4. 对于纯度很低的EV粗纯物的进一步纯化以提升纯度。

1.操作简便：无需特殊设备，直接孵育离心便可完成外泌体的分离，动手时间15min； 2.颗粒回收率高：二次回收效率仅收E1组分便可回收超过60%的外泌体颗粒； 3.除杂效率高：对于游离染料、荧光抗体、小分子等的去除效率超90%； 4.对样本无稀释作用：只收集E1样本，不会对样本造成稀释； 5. 性价比高：可对纯化柱进行清洗再生，重复5次使用。

1. 产品操作简单

2. 颗粒回收效率高 对不同体积的荧光孵育后的外泌体进行上样收集E1和E2，测定颗粒数，结果如下图1，上样100μl的情况下，颗粒总回收率（E1+E2的颗粒数/上样颗粒数）近80%。

3. 杂质去除效率高 对荧光标记后的外泌体进行不同体积上样，收集E1和E2，并经酶标仪检测荧光值，计算E1（1-E1荧光值/上样荧光值）或E2（1- E2荧光值/上样荧光值）组分的游离染料去除效率，上样100ul情况下去除效率超99%。

4. 荧光染色外泌体纯化相关实验测试 考虑到荧光染料标记外泌体进行体内外示踪是外泌体科研工作者几乎都要涉及的实验，但常规使用超滤等方法去除游离荧光染料时效果不佳，游离染料残留较多。我们将荧光染料标记外泌体后进行Exosupur®袖珍柱二次纯化的一些参数进行了进一步测试，主要测试了亲脂性荧光染料浓度是否影响游离染料去除效果，和重复使用是否影响颗粒回收率。 以不同浓度染料（2µg/ml-200µg/ml）分别上样100µl到Exosupur®袖珍柱，收集E1，酶标仪检测染料原液和回收液E1的荧光值，计算染料去除率，如图3所示。可见，染料浓度在10µg/ml以上时，Exosupur®袖珍柱的游离染料去除率稳定在98-99%以上。

分别使用5µg/ml和25µg/ml的亲脂性荧光染料标记外泌体后，上样100µl到Exosupur®袖珍柱，收集E1，通过纳米流式测定颗粒数，计算颗粒回收率，将Exosupur®袖珍柱再生后继续重复几次实验，如图4所示。可见，不管使用低浓度还是中高浓度荧光染料标记的外泌体，使用Exosupur®袖珍柱进行几次重复实验，颗粒回收率相对较稳定，约在60%以上。

5. 外泌体表征 经Exosupur®二次纯化后的外泌体进行三阳一阴WB检测和电镜TEM检测，显示不影响其生物学特征。

Q：该产品跟Exosupur ® 其他的分离试剂盒有何区别? A：该产品在原理上有升级，更适合微量样本的分离，处理样本体积为0.1~0.5ml，主要用于外泌体的二次纯化。其他SEC为原理的Exosupur ® 试剂盒主要用于大体积样本的分离，处理样本体积为0.2ml~10ml不等。 Q：上样量到底如何选择？ A：不同分离目的、不同样本体积的分离参数见图1-4，可以根据各自实验中的目的选择更高收率还是更高除杂率。如二次纯化时，50μl-500μl上样均能达到50%以上的收率（超滤一般为30%）和超过90%的除杂率； Q：操作过程中有何注意事项？ A：首先尽量保持管内填料处于湿润状态，离心后立即加液，如果不立即再生先加入缓冲液将下盖和螺旋盖子盖上拧紧暂时储存。其次，收到离心柱开始操作之前或操作过程中，若不小心将填料弄到管盖，可以加PBS清洗离心至管内。 Q：袖珍柱的清洗液1M NaOH 30%异丙醇，如何配置？ A：1M NaOH 30%异丙醇指的是NaOH的终浓度是1M，异丙醇的终浓度为30%（按照体积比）。以配置1L的1M NaOH 30%异丙醇为例，可取NaOH固体40.01g + 300ml异丙醇，用纯水定容到1L，配完后0.22um滤膜过滤。如果没有NaOH固体，以5M NaOH为例，配置100ml即为5M NaOH 20ml + 30ml异丙醇 + 50ml纯水，混匀后0.22um滤膜过滤。 Q：样本孵育过程中必须摇动吗？需要什么特殊仪器来摇起来？ A：建议最好是旋转孵育，使得样本与填料接触得更充分，能有更好的分离效果。不需要特殊的仪器，实验室所用的摇床就可以，80rpm摇动30min。 Q：旋转孵育过程中进入到管盖里有影响吗？ A：没有影响，孵育30min后一经离心就会都会进入Exosupur ® 袖珍柱中了。 Q：分离后的外泌体如何保存？ A：外泌体保存问题跟分离方法无关，是由其本身特性决定的，如果条件允许最好使用新鲜的外泌体进行实验，冻存的外泌体容易产生团聚并出现沉淀。实际研究中，外泌体功能实验往往需要大量的外泌体不得不分批提取保存时可-80℃保存；但做biomarker研究时，如RNA组学等，提取外泌体后需尽快完成RNA提取等后续实验。 Q：什么样的外泌体用袖珍柱可以提升电镜质量？ A：电镜下明显有一层杂质覆盖在表层，但能隐约看到囊泡，如下图所示，可以考虑使用袖珍柱二次纯化再次拍摄，以提升电镜质量。如只是杂质，不可见囊泡有一定概率是只有杂质，则不建议尝试。