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- 2025年07月29日
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免疫共沉淀中的ib
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免疫共沉淀中的IB技术解析
免疫共沉淀中的IB（Immunoblotting）作为dànbáizhì相互作用研究的关键验证手段，其核心在于通过特异性抗体识别经电泳分离的靶蛋白。该技术将免疫沉淀（IP）的富集能力与Western blot的高分辨率特性相结合，形成完整的IP-IB工作流程。在实验设计层面，免疫共沉淀中的IB首先要求优化裂解缓冲液组成，通常采用RIPA或NP-40为基础，需根据目标蛋白的亚细胞定位调整去垢剂浓度（如1% Triton X-100适用于膜蛋白）。值得注意的是，免疫共沉淀中的IB对蛋白酶抑制剂混合物的使用有严格要求，建议添加新鲜配置的PMSF（1mM）和wánquán蛋白酶抑制剂cocktail，以防止共沉淀复合物的降解。在抗体选择上，免疫共沉淀中的IB推荐使用经IP验证的一抗，其效价应通过棋盘滴定法确定，典型稀释范围在1:500-1:2000之间。转膜环节中，免疫共沉淀中的IB常采用PVDF膜（0.45μm孔径）配合湿转系统（100V，60分钟），对于大于100kDa的蛋白建议改用半干转或延长转膜时间。封闭步骤需考虑后续检测方法，5%脱脂牛奶适用于HRP系统，而BSA更适合碱性磷酸酶检测。具体费用需要根据实验需求和样品情况来确定。
免疫共沉淀中的IB在信号检测环节具有显著的技术特征。化学发光法作为主流检测手段，其灵敏度可达pg级，但需优化曝光时间以避免信号饱和。近年来，近红外荧光检测（如Odyssey系统）在免疫共沉淀中的IB应用逐渐增多，其线性范围比化学发光法宽10-100倍，特别适用于定量比较。数据分析时，免疫共沉淀中的IB要求设置严格的对照体系：包括输入对照（Input）、同型IgG阴性对照、以及目标蛋白的单独表达对照。密度定量建议使用ImageLab或ImageJ软件，需进行背景扣除和归一化处理。特别值得注意的是，免疫共沉淀中的IB结果解读需结合质谱数据或反向IP实验，以确认相互作用的直接性。对于弱相互作用体系，可尝试交叉连接剂（如DSP）预处理以稳定蛋白复合物。
在技术优化方面，免疫共沉淀中的IB面临的zuì大挑战是非特异性结合问题。采用预清除步骤（Pre-clearing）能有效降低背景，即用Protein A/G beads预先孵育细胞裂解液30分钟。洗涤缓冲液的严格性也需梯度测试，通常从低盐（150mM NaCl）到高盐（500mM NaCl）逐步优化。对于磷酸化蛋白的免疫共沉淀中的IB，缓冲液中需添加磷酸酶抑制剂（如10mM NaF+1mM Na3VO4）。膜再生技术（如Strip缓冲液）允许同一张膜多次探测，但需注意酸性Strip缓冲液（pH2-3）可能导致某些表位不可逆变性。近年来，定量免疫共沉淀中的IB通过引入内参蛋白（如GAPDH）的同步检测，使数据可比性显著提高。
常见问题：
Q1. 免疫共沉淀中的IB出现高背景信号的可能原因及解决方案？
A：主要源于抗体交叉反应或非特异性结合。建议进行抗体预吸附实验，使用同源组织裂解液预先孵育一抗；优化封闭剂（尝试使用3%BSA+0.1%Tween20）；增加洗涤严格性（如加入0.5M LiCl）；或改用单克隆抗体替代多克隆抗体。
Q2. 如何验证免疫共沉淀中的IB检测到的相互作用是否为直接相互作用？
A：需结合GST pull-down等体外结合实验进行确认。可构建目标蛋白的截短体进行结构域定位，或进行表面等离子共振（SPR）分析测定结合常数。冷冻电镜或X射线晶体学可提供直接相互作用的原子级证据。
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文献和实验在从事细胞信号转导的研究过程中我们常常需要探寻新的通路。在纵横交错，纷繁复杂的cross-talk中如何筛选可能的路径是signal transduction领域永恒的话题，而免疫共沉淀技术则是常用而简便的方法之一。 1. 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）技术是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。它能确定两种蛋白质在完整细胞内生理性的相互作用。 2. IP 利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合或细菌
「扰人清梦，如谋财害命」EHJ (IF=22) 报道中断睡眠会缩短寿命，女性尤甚
等可能影响结果的因素后，他们发现，总的来说，女性的唤醒负担低于男性。然而，那些唤醒负担超过其夜间睡眠 6.5% 的女性比唤醒负担较低的女性死于心血管疾病的风险更大：SOF 队列中的风险增加了 1 倍，SHHS 队列中的风险增加了 60%。在全因死亡率的关联分析中，SOF 组死亡风险增加 60%，SHHS 组死亡风险增加 20%。 图片来源：站酷海洛 Plus 把上述两项队列研究中的女性放在一起进行分析，结果表明那些唤醒负荷超过 6.5% 的女性死于心血管疾病的风险为 12.8%，这几乎是一般人群中
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。 注意：在准备做磷酸（酯）酶实验的时候，不加磷酸酯酶抑制剂。 一、工作液配制 配制 100 ml 的 modified RIPA buffe： 1.称取 790 mg 的 Tris-Base，加到 75 ml 去离子水中，加入 900 mg 的 NaCl，搅拌
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