背景简介
Annexin V(或 Annexin A5)为胞内蛋白膜联蛋白家族成员，以钙依赖的方式与磷脂酰丝氨酸(PS)结合。PS 存在于正常细胞浆膜的内层，但在凋亡早期，膜不对称性丧失，PS 易位至细胞表面。荧光标记的 Annexin V 可与之特异性结合，表明该细胞为凋亡细胞。
PI(碘化丙啶)是一种核酸染料，它不能透过正常细胞或早期凋亡细胞的完整的细胞膜，但可以透过凋亡晚期和坏死细胞的细胞膜而使细胞核染红。因此，将 Annexin V 与PI 联合使用时，PI 则被排除在活细胞(Annexin V- / PI-)和早期凋亡细胞(Annexin V+ / PI-)之外，而晚期凋亡细胞和坏死细胞同时被荧光标记的Annexin V 和 PI 结合染色呈现双阳性(Annexin V+ / PI+)。
Accutase 是一种天然的酶，兼具蛋白水解酶和胶原酶的活性。但它比胰酶和胶原酶更有效，使用浓度更低，使之毒性更小、更温和。因此对细胞的损伤更小，可减少因消化处理带来的假阳性。即便长时间消化， 也可保持90%以上的细胞活力。适合于各种贴壁细胞、胚胎和神经元干细胞等较敏感的细胞的消化。
本试剂盒仅需 15 分钟即可染色样本，快速方便。提供阳性质控液，便于制备单染管，调节补偿。提供消化细胞更温和的 Accutase，减少假阳性。
注：此凋亡试剂盒针对BD的C6流式细胞仪器进行优化。
试剂盒组分
| 目录号 | AT101C-30 | AT101C-60 | AT101C-100 | 储存条件 |
|---|---|---|---|---|
| 规格 | 30T | 60T | 100T | |
| Annexin V-FITC | 150 μl | 300 μl | 500 μl | 2 - 8℃，避光 |
| PI | 300 μl | 600 μl | 1000 μl | 2 - 8℃，避光 |
| 5 × Binding Buffer | 5 ml | 10 ml | 15 ml | 2 - 8℃ |
| Apoptosis Positive Control Solution | 5 ml | 5 ml | 5 ml | 2 - 8℃ |
| Accutase | 100 ml | 100 ml | 100 ml | -20℃，解冻后-20℃分装保存，或2 - 8℃可保存2 个月 |
使用方法
一、 细胞消化(不同类型的细胞，需要用户优化方案)
- 将 Accutase 于4℃或室温解冻，切勿放于 37℃解冻。
- 小心吸去细胞培养基 (如培养上清中存在凋亡细胞，则应收集)。
- (可选) 无菌PBS 洗涤。
- 加入适量解冻的 Accutase (不必温热至 37℃)，覆盖住细胞。根据细胞汇合度和密度情况，通常在T25细胞瓶中加入 2.5 - 5 ml Accutase。
- 室温放置 5 - 10 分钟，至多可长达 1 小时，无需终止。
- 当细胞开始圆缩，用手掌轻拍培养瓶，使细胞脱落。
- 温和地吹散细胞，收集细胞。
仪器参数调节
- 收集1 × 106- 3 × 106 个细胞，用预冷 PBS 离心洗涤两次，弃上清。
- 加入500 μl Apoptosis Positive Control Solution 重悬，置冰上孵育 30 分钟。
- 用预冷PBS 离心洗涤，弃上清。
- 加入适量预冷 1 × Binding Buffer 重悬，并加入数量相同且未经处理的活细胞与之混合。加入预冷1×Binding Buffer 补充至1.5 ml，等分成三管，其中一管为空白对照管、两管为单染管。5.单染管分别加入 5 μl Annexin V-FITC 或10 μl PI，室温避光孵育 5 分钟。6. 在流式细胞仪上，用空白管调节 FSC、SSC 和荧光通道的电压，并在此电压条件下，用单染管调节荧光通道的补偿。
三、 样本检测
- 按实验方案诱导凋亡。
- 用预冷 PBS 离心洗涤，收集1 - 10 × 105 个细胞(包括培养上清中的细胞)。用双蒸水稀释5 × BindingBuffer 为 1 × 工作液，取 500 μl 1 × Binding Buffer 重悬细胞。
- 每管加入5 μl Annexin V-FITC 和10 μl PI。
- 轻柔涡旋混匀后，室温避光孵育 5 分钟。
- 根据实验方法，进行流式分析。
- 流式分析
在流式细胞仪上，通过FITC 检测通道检测 Annexin V-FITC (Ex = 488 nm; Em = 530 nm)和通过PI 检测通道(Ex = 535 nm; Em = 615 nm)检测PI。
结果示例
