GST融合蛋白表达纯化

GST融合蛋白表达纯化技术原理与应用

 

gǔguānggāntàiS-转移酶(Glutathione S-transferase，GST)融合蛋白表达纯化系统是当前分子生物学和dànbáizhì工程中应用zuì为广泛的重组蛋白制备技术之一。该系统利用GST与gǔguānggāntài(Glutathione)之间的高亲和力特异性结合特性，通过亲和层析方法实现目标蛋白的一步纯化。GST标签由26kDa的GST蛋白构成，不仅作为纯化标签，还能增强部分重组蛋白的可溶性和稳定性。在表达阶段，目标基因通过分子克隆技术与gst基因融合，构建于原核或真核表达载体中，常用载体如pGEX系列已优化了多克隆位点和蛋白酶切位点设计。表达宿主多选择大肠杆菌BL21(DE3)等工程菌株，通过IPTG诱导表达后，细胞裂解上清可直接应用于gǔguānggāntài琼脂糖珠的亲和纯化。具体费用需要根据实验需求和样品情况来确定。

 

GST融合蛋白表达纯化的核心在于gǔguānggāntài亲和层析柱的选择与操作条件优化。还原型gǔguānggāntài通过巯基与琼脂糖珠共价偶联，形成稳定的亲和介质，对GST标签的结合容量可达10mg/ml介质。纯化过程通常包括结合、洗涤和洗脱三个关键步骤，其中洗涤缓冲液中常加入1% Triton X-100或类似去垢剂以减少非特异性结合。洗脱阶段采用10-20mM还原型gǔguānggāntài的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)，在温和还原条件下竞争性解离GST融合蛋白。为获得更高纯度产物，可在GST融合蛋白表达纯化后引入凝血酶或PreScission蛋白酶切步骤去除GST标签，再通过二次亲和层析分离目标蛋白。

 

在GST融合蛋白表达纯化过程中，温度控制和蛋白酶抑制剂的使用直接影响zuì终得率。表达阶段通常将培养温度降至16-25℃以减少包涵体形成，而纯化过程需在4℃环境下进行以维持蛋白稳定性。裂解缓冲液中需添加PMSF、EDTA等蛋白酶抑制剂复合物，特别当处理易降解的真核蛋白时。对于分子量大于60kDa的融合蛋白，可考虑在GST融合蛋白表达纯化系统中加入分子伴侣共表达载体，如GroEL/ES或Trigger factor，显著改善可溶性表达效率。近年发展的gǔguānggāntài磁性微球技术进一步简化了操作流程，适用于高通量筛选和自动化纯化平台。

 

GST融合蛋白表达纯化技术的应用已超越单纯的蛋白制备范畴。GST pull-down实验利用该系统的特性研究dànbáizhì相互作用网络，而GST融合蛋白固定的芯片可用于高通量筛选小分子抑制剂。值得注意的是，某些真核蛋白在原核系统中表达时可能形成错误折叠，此时需要调整GST融合蛋白表达纯化策略，如采用分段升温诱导或添加折叠辅助因子。对于后续需要结晶研究的蛋白，建议在GST标签去除后进行凝胶过滤层析精纯，以获得单分散性良好的蛋白样品。

 

常见问题：

 

Q1. 为什么有些GST融合蛋白在纯化过程中出现明显降解？

 

A：这通常由三个因素导致：一是宿主菌内源性蛋白酶活性未被充分抑制，建议使用蛋白酶缺陷型菌株如BL21(DE3)pLysS并优化抑制剂组合；二是目标蛋白本身存在不稳定结构域，可尝试在缓冲液中添加稳定剂如甘油或jīngānsuān；三是机械裂解过程产生过多热量，应采用温和的酶法裂解或严格控制超声条件。

 

Q2. 如何解决GST融合蛋白与亲和介质结合能力下降的问题？

 

A：结合效率降低可能源于gǔguānggāntài配体脱落或氧化，应定期用DTT还原介质并避免反复冻融。对于某些特殊融合蛋白，可测试不同离子强度的结合缓冲液(如含150-500mM NaCl)，并确认溶液pH严格维持在7.4-8.0范围。若仍不理想，建议改用新鲜活化的介质或尝试不同品牌的亲和树脂。