本试剂盒仅供科研使用
γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）活性测定试剂盒
（货号：WS4120F 分光法 48 样）
一、产品简介：
γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS，EC 6.3.2.2)是谷胱甘肽(GSH)合成中的限速酶，催化
谷氨酸和半胱氨酸合成γ-谷氨酸半胱氨酸(γ-GC)。有研究表明该酶在细胞的氧化应激过程
中具有一定作用。
在 ATP、镁离子存在下，γ-GCS 催化谷氨酸和半胱氨酸合成γ-谷氨酰半胱氨酸(γ-GC)，
同时 ATP 去磷酸化产生无机磷分子，通过测定无机磷增加速率，即可计算出γ-GCS 活性。
二、测试盒组成和配制：
【注】：全程需无磷环境；试剂配置最好用新枪头和玻璃移液器等，也可用一次性塑料器皿，避免磷污染。
三、所需的仪器和用品：
可见分光光度计、1mL玻璃比色皿（光径1cm）、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、
研钵、冰和蒸馏水。
四、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）活性测定：
建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验
样本和试剂浪费！
1、样本制备：
① 组织样本：称取约 0.1g 组织（水分充足的样本可取 0.5g），加入 1mL 提取液，进行
冰浴匀浆。 4℃×12000rpm 离心 10min，取上清，置冰上待测。
【注】：若增加样本量，可按照组织质量（
g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例进行提取。
② 细菌/细胞样本：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约 500 万细菌或细
胞加入 1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 200W，超声 3s，间隔 10s，
重复 30 次）；12000rpm 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
【注】：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量（104）：提取液（mL）为 500~1000：1 的比例进行提取。
③ 液体样本：直接检测；若浑浊，离心后取上清检测。
2、上机检测：
① 可见分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 700nm，蒸馏水调零。
② 所有试剂解冻至室温（25℃），在 EP 中依次加入：
试剂名称
规格
保存要求
备注
提取液
液体 50mL×1 瓶
4℃保存
试剂一
液体 30mL×1 瓶
4℃保存
试剂二
粉体 mg×1 支
-20℃保存
临用前甩几下使粉末全部落入底部，加
入 2.2mL 的试剂一，混匀溶解备用。
试剂三
粉体 mg×1 支
4℃保存
临用前甩几下使粉末全部落入瓶底，加
入 4.4mL 的试剂一，混匀溶解备用。
试剂四
液体 10mL×1 瓶
4℃保存
试剂五
A:粉体 mg×1 瓶
B:液体 6mL×1 瓶
4℃保存
临用前在试剂 A 中加 5.8mL 的 B 液，
再加 74.2mL 的蒸馏水，混匀溶解备用。
标准品
粉体 mg×1 支
4℃保存
若重新做标曲，则用到该试剂
试剂名称（μL）
测定管
对照管
试剂一
100
100
试剂二
20
20本试剂盒仅供科研使用
2
③ 显色反应，在 1mL 玻璃比色皿中加入：
五、结果计算：
1、标准曲线方程：y =0.8474x - 0.0164，x 是标准品摩尔质量（μmol/mL）, y 是△A。
2、按蛋白浓度计算：
定义：每小时每毫克组织蛋白催化产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。
γ-GCS 酶活力(μmol/h/mg prot)= [(△A+0.0164)÷0.8474×V2] ÷(V1×Cpr)÷T
=17.7×(△A+0.0164)÷Cpr
3、按样本鲜重计算：
定义：每小时每克组织催化产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。
γ-GCS 酶活力(μmol/h/g 鲜重)= [(△A+0.0164)÷0.8474×V2]÷(W× V1÷V)÷T
=17.7×(△A+0.0164)÷W
4、按细菌或细胞密度计算：
定义：每小时每 1 万个细菌或细胞催化产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。
γ-GCS 酶活力(μmol/h /104 cell)= [(△A+0.0164)÷0.8474×V2]÷(500×V1÷V)÷T
=0.0354×(△A+0.0164)
5、液体中γ-GCS 活力计算:
定义：每小时每毫升液体催化产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。
γ-GCS 酶活力（μmol/h/mL）=[(△A+0.0164)÷0.8474×V2]÷V1÷T=17.7×(△A+0.0164)
V---提取液体积，1mL；
V1---样本体积，0.04mL ； V2---酶促反应总体积，0.3mL；
T---反应时间，1/2 小时；
W---样本鲜重，g；
500---细菌或细胞总数，500 万；
Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。
附：标准曲线制作过程：
1
制备标准品母液（5μmol/mL）：标准品用 10mL 试剂一溶解。（母液需在两天内用）。
2
把母液稀释成六个浓度梯度的标准品：0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1. μmol/mL。也可根据实际样本来调整
标准品浓度。
3 依据显色反应阶段测定管的加样体系操作，根据结果即可制作标准曲线。
样本
40
试剂三
40
40
混匀后立即 37℃准确孵育 30min。
试剂四
100
100
样本
40
混匀，12000rpm，4℃离心 5min，上清液待测
上清液
150
150
试剂五
600
600
混匀，室温静置 3min，700nm 下读取各管吸光值，
△A=A 测定-A 对照（每个样本做一个自身对照）。
文献和实验
