ReadiLink Rapid XFD(AF) 750 抗体

ReadiLink 快速抗体标记试剂盒专为大量抗体标记而研发，提供了一种方便高效的方法，可使用我们优质的 iFluor® 染料、XFD 染料（相当于 Alexa Fluor®）和各种其他标记来标记大量抗体。这些试剂盒利用用琥珀酰亚胺酯 (SE) 官能团修饰的反应性荧光团，选择性地与蛋白质上的伯胺结合，产生非常明亮且光稳定的缀合物。每个试剂盒都包含三种不同标记反应所需的所有组分，并配备预装旋转柱，可有效去除染料，最大限度地提高缀合物产量。试剂盒中提供的每瓶 XFD 750 SE 染料均经过精确配制，可标记 1 mg 纯化的蛋白质或抗体。在标记之前，重要的是从样品中去除 BSA 等稳定蛋白，并避免使用 Tris 等富含胺的缓冲液，这可能会破坏标记过程。 XFD 750 SE 是一种明亮的近红外荧光染料，激发和发射最大值分别为 ~752 nm 和 ~776 nm，使其成为Alexa Fluor® 750（Alexa Fluor® 是 Invitrogen 的商标）的替代品。 XFD 750 标记抗体非常适合高丰度靶标的直接成像。

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实验前的准备

1. 1.0 mg 抗体（MW ~150 kDa）

2. 抗体浓度：2.0 mg/mL

3. 抗体体积：500 µL

 

操作方案

在打开小瓶之前，先加热所有组分并短暂离心。在开始缀合之前立即准备必要的解决方案。

 

抗体标记反应

1.将一小瓶活性染料（组分 A）加热至室温。

注：注意：每瓶活性染料含有优化量的染料，可在 PBS 中以 2 mg/mL 标记 1 mg IgG (MW ~150 kDa)，该试剂盒还可用于标记其他蛋白质 (>10 kDa)。

2.将 10 µL DMSO（组分 D）添加到活性染料（组分 A）小瓶中，混匀。

3.在 PBS 中制备 500 µL 抗体溶液，浓度为 2 mg/mL。

注1：蛋白质应溶解在 1X 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)（pH 7.2 - 7.4）中。如果蛋白质溶解在含有伯胺（如 Tris 和/或甘氨酸）的缓冲液中，则必须使用 1X PBS（pH 7.2 - 7.4）进行透析，或使用 Amicon Ultra0.5、Ultracel-10 膜、10 kDa（货号 UFC501008）来自 Millipore）以去除用于蛋白质沉淀的游离胺或铵盐（例如硫酸铵和醋酸铵）。

注2：不纯的抗体或用牛血清白蛋白 (BSA) 或明胶稳定的抗体不会被很好地标记。

4.将 25 µL 反应缓冲液（组分 B）添加到抗体溶液中。

5.将重新配制的染料溶液转移至抗体溶液小瓶中，并用移液器吹打数次以充分混合。

6.将反应混合物在室温下旋转1小时。

 

用脱盐柱纯化

1.拧开脱盐柱（组分 D）的底部封闭口，然后松开盖子。将柱体放入收集管中。

2.将柱体以 1,000 g 离心 2 分钟以除去储存溶液。

3.取下盖子，慢慢将 1 mL 的 PBS 添加到柱中。 1,000 g 离心 2 分钟并除去缓冲液。重复此步骤 3 次，每次从收集管中丢弃缓冲液。

4.将柱体放入新的收集管中，然后轻轻地将样品涂抹到致密树脂床的中心。

5.将色谱柱以 1,000 g 离心 2 分钟以收集样品。

 

确定抗体浓度和标记程度（可选）

1.可以使用以下公式计算抗体浓度：(A₂₈₀ - CF₂₈₀ x A_dye) / 1.4

2.可以使用以下公式来计算标记程度：DOL = (A_dye / Ec_dye) / (A₂₈₀ - CF₂₈₀ x A_dye) / 210,000)

注：①210,000 是 IgG 在 280 nm 处的摩尔消光系数 (Ec)，单位为 cm-1M-1。 ②CF280 是荧光团对 280 nm 吸光度影响的校正因子。 ③Adye 是相应染料的最大吸光度 (λmax)。

 

表 1. ReadiLink 快速抗体标记试剂盒中标记染料的特性。

Cat#	Dye	Mol. Wt.	Ec (cm-1M-1)	CF280	Target DOL
5700	iFluor® 350	749.85	20,000	0.23	5-10
5702	iFluor® 488	945.07	75,000	0.21	4-8
5705	iFluor® 555	914.06	90,000	0.16	4-7
5710	iFluor® 594	1160.42	18,000	0.04	3-6
5713	iFluor® 647	1274.66	250,000	0.03	3-7
5718	iFluor® 750	1416.83	250,000	0.039	2-6
5720	FITC	620.52	75,000	0.183	3-6
5722	Cy3	829.03	150,000	0.073	1-3
5725	Cy5	855.07	250,000	0.03	2-4
5727	Cy7	881.11	250,000	0.036	2-4
5730	XFD488	643.4	71,000	0.11	4-8
5733	XFD555	1250	150,000	0.08	4-7
5736	XFD594	819.85	90,000	0.56	3-6
5740	XFD647	1259.66	240,000	0.03	3-7
5745	XFD750	1300	240,000	0.04	2-5

 

参考文献

 

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