Amplite NADP+/NADPH检测试剂盒(比色法)

Amplite NADP+/NADPH检测试剂盒（比色法）是AAT Bioquest研发的检测NADP+/NADPH的试剂盒，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD +）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP +）是细胞中发现的两种重要的辅因子。NADH是NAD +的还原形式，NAD +是NADH的氧化形式。 NAD形成NADP，通过酯键将磷酸基团添加到腺苷核苷酸的2'位置。NADP用于合成代谢生物反应，例如脂肪酸和核酸合成，其需要NADPH作为还原剂。在叶绿体中，NADP是在光合作用的初步反应中重要的氧化剂。通过光合作用产生的NADPH用作卡尔文光合作用循环中生物合成反应的还原能力。传统的NAD / NADH和NADP / NADPH测定通过监测340nm处NADH或NADPH吸收的变化来完成。该方法具有低灵敏度和高干扰，因为该测定在需要昂贵的石英微孔板的UV范围内进行。

Amplite™比色总NADP和NADPH检测试剂盒为敏感检测NADP和NADPH提供了一种便捷的方法。 系统中的酶特异性识别酶循环反应中的NADP / NADPH，其显着提高了检测灵敏度。 此外，该测定具有非常低的背景，因为其在较长波长范围内运行，这显著降低了来自生物样品的干扰。 该实验证明了高灵敏度和低干扰。，为您提供优质的Amplite NADP+/NADPH检测试剂盒。

Amplite™比色总NADP和NADPH分析试剂盒提供灵敏的一步法分析，可在100μL分析体积（100 nM）内检测少至10皮摩尔的NADP（H）。 该测定可以以方便的96孔或384孔微量滴定板形式进行，并且容易适应自动化而无需分离步骤。 其信号可通过吸光度酶标仪在~575nm或~570nm至~605nm的吸光度比下轻松读取，以提高测定灵敏度。 如果需要更高的灵敏度，建议使用Cat#15259或15264。

 

适用仪器

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光吸收酶标仪
吸收:	575 ± 5 nm
推荐孔板:	透明底板

96孔板测定示例

概述

准备NADP / NADPH反应混合物（50μL）

加入NADPH标准品或测试样品（50μL）

在室温下孵育15分钟--2小时

监测575±5nm处的吸光度强度

注意：在开始实验之前，在室温下解冻每个试剂盒组分中的一个。

 

操作方法

1.准备NADPH原液：

将200μLPBS缓冲液加入到NADPH标准品（组分C）的小瓶中，得到1mM（1nmol / L）NADPH储备溶液。

注意：未使用的NADPH原液应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。

2.制备NADP / NADPH反应混合物：

将10mL NADP / NADPH传感器缓冲液（组分B）加入NADP / NADPH再循环酶混合物（组分A）的瓶中，并充分混合。

注意：这种NADP / NADPH反应混合物足以用于两个96孔板。 未使用的NADP / NADPH混合物应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。

3.准备NADPH标准品的连续稀释液（0至10μM）：

3.1将10μLNADPH储备溶液（来自步骤1）加入990L PBS缓冲液中以产生10M（10pmol / L）NADPH标准溶液。

注意：稀释的NADPH标准溶液不稳定，应在4小时内使用。

3.2取200μL10μMNADPH标准溶液进行1：3连续稀释，得到NADPH标准品的3,1,0.3,0.1,0.03,0.01,0.003和0μM连续稀释液。

3.3如表1和表2所述，将NADPH标准品和含有NADP / NADPH的测试样品的系列稀释液加入白色/透明底96孔微孔板中

注意：根据需要准备细胞或组织样本。

 

表1在白色/透明底96孔微孔板中的NADPH标准品和测试样品的布局

BL	BL	TS	TS
NS1	NS1	….	….
NS2	NS2
NS3	NS3
NS4	NS4
NS5	NS5
NS6	NS6
NS7	NS7

注意：NS = NADPH标准，BL =空白对照，TS =测试样品。

 

表2.每个孔的试剂组成

NADPH Standard	Blank Control	Test Sample
Serial Dilutions*: 50 μL	PBS: 50 μL	50 μL

注意：将连续稀释的NADPH标准品从0.003μM至3μM加入NS1至NS7的孔中，一式两份。 高浓度的NADPH（例如，>100μM，终浓度）可能由于NADPH传感器的过度氧化而导致信号降低。

 

4.在上清液中运行NADP / NADPH测定：

4.1将50μLNADPH反应混合物（来自步骤2）加入NADPH标准品，空白对照和测试样品的每个孔中（参见步骤3.3），使总NADPH测定体积为100μL/孔。

注意：对于384孔板，每孔加入25μL样品和25μLNADPH反应混合物。

4.2在室温下孵育反应15分钟至2小时，避光。

4.3用吸光度读数仪在575±5 nm或~570 nm至~605 nm的吸光度比下观察吸光度的增加，以提高检测灵敏度。

注意1：对于NADP / NADPH比率测量，建议使用试剂盒15263。

注意2：对于基于细胞的NADP / NADPH测量，建议使用ReadiUse™哺乳动物细胞裂解缓冲液* 5X *（Cat#20012）裂解细胞。

 

数据分析

        空白孔中的吸光度（仅用PBS缓冲液）用作对照，并从NADPH反应孔的值中减去。 NADPH标准曲线如图1所示。

        注意：吸光度背景随时间增加，因此减去每个数据点的空白孔的吸光度非常重要。

图1.使用NOVOStar酶标仪（BMG Labtech），在白色/透明底96孔板中用Amplite™比色总NADP和NADPH测定试剂盒测量NADPH剂量反应。 在孵育1小时（n = 3）时可以检测到低至100nM（10pmol /孔）的NADPH，而NADH没有响应。

 

参考文献

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