糖原检测试剂盒，比色法

本试剂盒采用比色法测定样本中的糖原含量，测定原理如下：糖原在浓硫酸的作用下脱水生成糖醛衍生物，该衍生物进一步与蒽酮反应生成蓝色化合物，通过与标准葡萄糖溶液进行比色定量，可以准确测定样本中的糖原含量。

本产品使用快速简便，重复性强，适用于组织、细胞等样本的糖原测定，可测50例左右样本。

 

产品信息

货号	60423ES50
规格	50 T
检测范围	0.1-20 mg/g组织

组分信息

组分编号	组分名称	装量	储存条件
60423ES-A	碱溶液	40 mL×1瓶	2～8℃
60423ES-B	葡萄糖标准贮备液（1 mg/mL）	1 mL×1支	2～8℃
60423ES-C	显色剂贮备液	粉剂×6 支	2～8℃

备注：

1）葡萄糖标准贮备液，使用前将1 mg/mL葡萄糖标准品贮备液∶双蒸水 = 1∶99 的比例混合配成0.01 mg/mL葡萄糖标准应用液，用多少配多少，现用现配，当天有效。

2）显色剂贮备液，使用前每支加浓硫酸25 mL混匀，配成显色剂应用液，现用现配。（浓硫酸浓度必须为95%-98%的分析纯，并且不可开瓶太久，避免浓度降低）  

3）配制显色剂的容器和量筒必须绝对干燥，否则会使试显色剂贮备液无法充分溶解。配制显色剂时，先将粉剂倒入烧杯中，然后加少量浓硫酸（约10 mL），用玻棒小心搅拌，使其充分溶解，然后再加入剩余的浓硫酸，充分搅拌后室温避光保存。

使用说明

1.仪器试剂准备

含620 nm波长的分光光度计、1 cm光径比色皿、100℃水浴锅、台式低速离心机、各种规格移液器、双蒸水、烧杯、玻璃棒、量筒、生理盐水（0.9%）或PBS（0.1M）、涡旋混匀器、玻璃试管或离心管（耐硫酸）、蛋白测定试剂、浓硫酸。

2.样本前处理

1）组织样本处理

① 取样：取组织样本（如肝脏或肌肉）用生理盐水漂洗后，滤纸吸干，称重（样本重量≤100 mg为宜，不要＞100 mg）。

② 水解：按样本重量（mg）∶碱液体积（μL）= 1∶3，一起加入试管中，沸水浴煮20 分钟，流水冷却。

例如：肝脏组织称重75 mg按重量体积比1∶3应加入碱液的量为225 μL；肌肉组织称重85 mg按重量体积比1∶3应加入碱液的量为255 μL。

③ 将糖原水解液进一步制备成糖原检测液：

肝糖原检测液为1%，加双蒸水的量为：肝脏重量×100 - 肝脏重量×4* = 肝脏重量×96

肌糖原检测液为5%，加双蒸水的量为：肌肉重量×20 - 肌肉重量×4* = 肌肉重量×16

[注]：4*为水解时碱液与组织的体积数。

例如：肝脏组织称重75 mg，制备1%肝糖原检测液，加双蒸水的量为：75×96 = 7200 μL = 7.2 mL；肌肉组织称重85 mg，制备5%肌糖原检测液，加双蒸水的量为：85×16 = 1360μL = 1.36 mL。

2）细胞样本处理

① 细胞沉淀的收集（细胞数量在100万个以上）

对于悬浮培养的细胞，直接取细胞悬液，1000转/分钟，离心10分钟，弃上清留细胞沉淀。

对于贴壁培养的细胞，用胰酶将细胞消化下来，或用细胞刮将细胞刮下来，制成细胞悬液，1000转/分钟，离心10分钟，弃上清留细胞沉淀。

② 细胞沉淀的洗涤

在细胞沉淀中加入0.5～1 mL的缓冲液（0.1 mol/L pH 7～7.4磷酸盐缓冲液或生理盐水），轻轻混匀，1000转/分钟，离心10分钟，弃上清留细胞沉淀。

③ 水解

a.破碎后水解（适用于未知细胞数量或者细胞数量差异较大的样本）：细胞沉淀加入0.2～0.5 mL缓冲液（0.1 mol/L pH 7～7.4磷酸盐缓冲液或生理盐水），冰水浴条件下超声破碎或手动匀浆，不离心，直接取样（取出部分测总蛋白浓度）0.05 mL 加入碱溶液0.15 mL，沸水浴20分钟，流水冷却，即为糖原检测液。

b.不破碎直接水解（适用于细胞总数相近或不考虑细胞总数的样本）：每管中加入碱溶液0.225 mL，沸水浴20分钟，流水冷却，加双蒸水0.225 mL，即为糖原检测液。

3）脂肪肝样本处理

① 取样：取新鲜肝脏样本用生理盐水漂洗后，滤纸吸干，称重（样本重量≤100 mg为宜，不要＞100 mg）。

② 水解：按样本重量（mg）∶碱液体积（μL）= 1∶3，一起加入试管中，沸水浴煮20分钟，流水冷却。

③ 将糖原水解液进一步制备成糖原检测液：

肝糖原检测液为5%，加双蒸水的量为：肝脏重量×20 - 肝脏重量×4* = 肝脏重量×16

注：4*为水解时碱液与组织的体积数。

④ 检测液除脂：取上述制备好的检测液（一般可见检测液上层漂浮有乳白色油状物），加入一定量的氯仿，可按照检测液量(mL)：氯仿(mL)= 4：1,漩涡混匀，3500 转/分钟，离心10分钟，取上清用于测定（如含量较高，需稀释后再测定）。

3.操作表

[注]：加完显色液必须充分混匀后再沸水浴，否则会出现絮状物。

试剂	空白管	标准管	测定管
双蒸水(mL)	1.0		0.9
0.01 mg/mL标准(mL)		1.0
糖原检测液(mL)			0.1
显色液(mL)	2	2	2
混匀后置沸水中煮5分钟，取出冷却后混匀，于620 nm波长，1 cm光径，空白管调零，测各管OD值

4.计算公式

1）组织样本计算公式：

糖原含量（mg/g组织）=(A测定/A标准)× m标准 × N × 10 ÷ 1.11

其中，m标准：表示标准管含糖量，0.01 mg；N：表示样本测试前稀释倍数。即为组织样本处理的步骤三③ ，肝脏为100，肌肉为20（需要注意的是，不同物种肝肌糖原含量不同，如第一次做本实验，可在制备水解液时统一先制备成5%浓度的，然后再以预实验看浓度高低，如偏高则再稀释后测定）。

2）细胞样本计算公式：

① 破碎后水解的细胞计算：

糖原含量（mg/mgprot）=(A测定÷ A标准)× C标准 × 10 ÷ 1.11÷ Cpr

其中，C标准：表示标准品浓度，0.01 mg/mL；Cpr：表示细胞匀浆蛋白浓度，mgprot/mL（prot指蛋白）。

② 不破碎直接水解的细胞计算公式：

糖原总量（mg）=(A测定÷ A标准)× C标准 × 10 ÷ 1.11 × V样总

其中，C标准：表示为标准品浓度，0.01 mg/mL；V样总：制备得到的糖原检测液总体积，0.5 mL。

③ 脂肪肝样本计算公式公式：

糖原含量（mg/g组织）=(A测定÷A标准)× m标准 × N × 10 ÷ 1.11

其中，m标准：表示标准管含糖量，0.01 mg；N：表示样本测试前稀释倍数。即为脂肪肝样本处理的步骤三③中稀释倍数20；10：表示测试过程中的稀释倍数（如样本糖原含量较低，也可降低这个稀释倍数或不稀释）；1.11：表示此法测得的葡萄糖含量换算成糖原含量的系数，即100 μg糖原用蒽酮试剂显色的颜色相当于111 μg葡萄糖用蒽酮试剂显色的颜色。

 

2～8℃保存，有效期6个月。