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- 2026年01月04日
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上海达为科生物科技有限公司
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CRISPR/Cas9动物模型
一、技术原理与核心突破
CRISPR/Cas9系统源于细菌适应性免疫机制，通过双RNA引导实现靶向DNA切割：
- 引导机制：
- crRNA（CRISPR RNA）识别靶序列，tracrRNA（反式激活crRNA）激活Cas9酶，两者可融合为sgRNA（单链引导RNA）。
- PAM序列（5'-NGG-3'）是Cas9切割的必要位点，位于靶基因下游。
- 切割模式：
- Cas9的HNH结构域切割互补链，RuvC-like结构域切割非互补链，形成双链断裂（DSB）。
- 修复路径：
- 非同源末端连接（NHEJ） ：易产生插入/缺失突变（Indels），导致基因敲除。
- 同源定向修复（HDR） ：需提供同源修复模板（ssODN或载体），实现精准插入或点突变。
革命性突破：CRISPR/Cas9首次实现哺乳动物细胞的高效、可编程基因编辑，且支持多靶点同步编辑。
二、动物模型构建策略与技术优化
（一）核心操作流程
（二）关键技术参数
| 步骤 | 关键操作 | 优化方案 |
|---|---|---|
| sgRNA设计 | 靶向基因外显子区，避开脱靶位点（工具：CRISPRscan） | 添加5'端G增强转录效率 |
| 编辑组件递送 | - mRNA注射：Cas9 mRNA + sgRNA（小鼠受精卵） - 蛋白注射：Cas9-sgRNA核糖核蛋白（RNP） |
RNP减少脱靶效应 |
| 同源重组增强 | 联合注射ssODN（单链寡核苷酸）及重组增效剂（如RS-1） | RS-1提升HDR效率3-5倍 |
| 胚胎移植 | C57BL/6品系受精卵 → 假孕母鼠（ICR或BALB/c） | 移植存活率>60% |
（三）模型类型与构建效率
| 模型类型 | 构建方法 | 周期 | 效率 | 案例 |
|---|---|---|---|---|
| 基因敲除（KO） | NHEJ修复诱导移码突变 | 3-4个月 | 80% F0代突变 | 免疫缺陷鼠（Rag2/IL2rg双敲） |
| 点突变模型 | HDR修复+ssODN模板 | 4-6个月 | 20-40% | 阿尔茨海默病（tau-V337M） |
| 条件性敲除 | 双sgRNA靶向flox区域 + Cre小鼠杂交 | 6-8个月 | 50% F1代重组 | 肺癌模型（LoxP-Kras/p53） |
| 大片段敲入 | BAC载体同源重组 + CRISPR切割 | >8个月 | 10-15% | 人类疾病基因人源化模型 |
三、疾病模型应用与前沿案例
（一）肿瘤模型
- 肝癌：
- 同步靶向肝细胞抑癌基因 PTEN 和 P53，8周内诱发肝癌。
- 脑瘤：
- 多基因编辑（Ptch1/Trp53/Pten/Nf1）构建成神经管细胞瘤模型。
- 肺癌：
- 组织特异性模型：条件性Cas9小鼠 + AAV9递送sgRNA（靶向Kras/p53/Lkb1），实现肺组织特异性致癌。
（二）遗传病模型
| 疾病 | 靶基因 | 表型特征 | 研究价值 |
|---|---|---|---|
| 白化病 | 酪氨酸酶（Tyr） | 毛发/视网膜色素缺失 | 基因治疗载体验证 |
| 威尔逊病 | ATP7B | 铜代谢障碍→肝损伤 | 基因修复疗法测试 |
| 血友病乙 | F9（凝血因子Ⅸ） | 出血倾向 | 体内基因编辑疗效评估 |
（三）神经与代谢疾病
- 阿尔茨海默病：
- MAPT突变模型：CRISPR/Cas9编辑小鼠tau蛋白基因，模拟神经纤维缠结。
- 糖尿病：
- db/db小鼠改良：CRISPR精准引入Lepr突变，缩短模型构建周期至12周。
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文献和实验诺奖得主 Science 发文：基因编辑诞生 10 年，未来将如何改变世界？
程的基因组编辑工具。（A）CRISPR 免疫系统靶向微生物中的 DNA 或 RNA。（B）CRISPR-Cas9 是用于 RNA 引导的遗传操作的规范基因组编辑工具。（来源：Science） CRISPR 诱导的基因敲除 CRISPR-Cas9 具有高靶向特异性和有效性，能够成功快速创建敲除小鼠和其他动物模型（图 2B）。传统的基因靶向方法需要在胚胎干细胞（ES）中使用低效的同源重组，然后费力地筛选修饰的 ES 细胞以获得所需的序列变化并注射到胚胎中。而 CRISPR-Cas9 能够在单细胞
动物模型构建CRISPR-Cas9 系统作为最新一代基因编辑技术，能够简便高效地实现基因组精确 修饰，是制备哺乳动物疾病模型的重要工具。目前科学家利用 CRISPR-Cas9 技术在动物模型，如小鼠、大鼠、猪 和猴等研制方面做出一系列重要工作。如科学家们将 CRISPR-Cas9 系统导入小鼠受精卵，成功获得了有特定基因突变的小鼠模型，并获得近乎 100% 的基因靶向突变效率，极大地降低了基因编辑小鼠模型制备的难度和成本，有望被广泛应用。背景：使用自主研发的sgRNA设计平台为一个基因位点设计
都非常容易设计并且价格低廉。 此外，采用 CRISPR-Cas9 系统可以在不到一个月的时间内，就能将设想付诸于动物模型上。CRISPR-Cas9 系统这种简单性、经济性、高效性，使得研究人员得以扭转在技术上和经费上不可行的问题。 本文详细讨论了小鼠基因工程中当运用 Cas9 时，所遇到的实际问题。 原标题：CRISPR-Cas9 系统在小鼠基因组编辑中的应用（Editing the Mouse Genome Using the CRISPR–Cas9 System）
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