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- 赛默飞（Thermo Fisher）
- 3725-MSM1-P1ABX
- 2025年07月14日
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文献和实验Using Phospho‐Motif Antibodies to Determine Kinase Substrates
Figure 18.20.1 The specificity of phospho‐motif antibodies. HeLa cells were serum‐starved for 24 hr prior to being stimulated with 50 ng/ml IGF‐1 or 100 nM PMA for 10 min. Lysates were immunoblotted with anti‐Akt/PKB phospho‐motif (left panel
碧峤 wrote: pAkt有两个位点，Ser473和Thr308，其中Ser473相对容易显色。如果显色失败，可能的原因:1 上样量过少，我们一般都是30μg；2 一抗孵育时间过短，我们一般24h~48h；3 一抗是否工作有待排除 我上样量上的15ug，一抗孵育大约18个小时，就是头天下午孵育上，第二天早上就洗膜了，之前做过一次pakt,一样的过程，出了一次，再以后就没出了。今天我们换了下不同组的同一组织，比较新，试下，不知道明天出不出
活性激酶：纯化重组蛋白，或经IP富集后保留活性的激酶； · 候选底物：纯化全长蛋白、蛋白片段或合成肽段； · ATP和Kinase Buffer：提供磷酸基团及Mg²⁺等激酶反应所需环境； · 磷酸化检测体系：磷酸化位点抗体、泛p-Ser/Thr/p-Tyr抗体、放射性ATP、Phos-tag或质谱等。 正式实验前先确认重组蛋白纯度和浓度。激酶还要关注活性状态，底物则尽量使用结构完整、可溶性好的蛋白。 如果已经预测出具体磷酸化位点，可以同步准备WT底物和磷酸化位点突变体，例如Ser/Thr常做
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