- ￥700
- 烜雅生物
- XY-ZL0019
- 国产
- 2025年12月18日
企业认证
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 库存：
200
- 英文名：
pRSFDuet-1
- 保质期：
２年
- 供应商：
上海烜雅生物科技有限公司
- 保存条件：
2-8℃
- 规格：
质粒干粉
英文名称：pRSFDuet-1
形式：质粒干粉
参考用途：大肠系列质粒；大肠其它质粒；大肠双框质粒 蛋白表达
培养基：酵母膏：5.0，蛋白胨：10.0，NaCl：10.0，pH：7.0(25℃)
生长条件：LB +卡那霉素，37℃（克隆菌株DH5a，3829bp）
存储条件：2-8℃
安全等级：1
操作步骤：
1.溶解： 收到质粒干粉后，请加入 20μl 无菌水至管底，溶解质粒，室温静置 1min；
2.混合（吸附质粒）： 200μl 感受态细胞 + 质粒 DNA 5~10µl 混匀，冰上放置 30min；
3.热激导入： 42℃静置 90s；
4.收缩膜孔： 冰浴 2min；
5.修复培养： 毎管加 800µl LB 液体培养基，37 ℃培养 1h 150 r/min；
6.筛选培养： 将适当体积（100 µl）的复苏细胞，涂布在相应抗性的 LB 平板上，正置平皿 30min（琼脂面务必干燥后）， 倒置培养 12-16h，出现菌落。
7.提取： 挑取单克隆菌落至相应抗性 LB 液体培养基中，震荡培养 12-16h，根据试验需要提取质粒。
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文献和实验不含DE3片段的菌株中进行克隆筛选，之后再把阳性克隆转化进入表达菌株，如BL21（DE3）中，通过IPTG诱导进行表达。而pETcoco载体它引入了低拷贝控制元件，F附加体上的oriS和repE元件与parABC共同作用下使质粒在细菌中保持单拷贝，这样即可以使质粒在细菌内稳定存在又可以减少外源蛋白对细胞的毒害作用。当我们需要大量表达时加入树胶醛醣诱导trfA基因表达，质粒在细胞内的拷贝数就可以增加到25-50。pETcoco载体同时兼容了DE3调控模型，在加入IPTG后诱导表达量达升高2500倍
。而pETcoco载体它引入了低拷贝控制元件，F附加体上的oriS和repE元件与parABC共同作用下使质粒在细菌中保持单拷贝，这样即可以使质粒在细菌内稳定存在又可以减少外源蛋白对细胞的毒害作用。当我们需要大量表达时加入树胶醛醣诱导trfA基因表达，质粒在细胞内的拷贝数就可以增加到25-50。pETcoco载体同时兼容了DE3调控模型，在加入IPTG后诱导表达量达升高2500倍。 在保证质粒稳定性这一点上除了pETcoco的方法还有另一种方法就是将重组质粒转化进入含有T7 RNA聚合酶抑制剂的T7溶菌
粗心人。这样的错误会给将来的克隆造成麻烦。b)如果打算PCR后直接酶切，不要忘了在酶切位点的外侧再加上保护碱基，不同的酶对于保护碱基的要求是不同的。如果不设计保护碱基，则多半要用TA克隆的方式连接到质粒上，这时要注意Taq 酶的选择。若想在目的序列上附加上并不存在的序列，如限制位点和启动子序列，可以加入到引物5'端而不影响特异性。当计算引物Tm值时并不包括这些序列，但是应该对其进行互补性和内部二级结构的检测。十、有时候，对于引物设计仅了解有限的序列信息。比如，如果仅知道氨基酸序列，可以设计兼并
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