封闭液（山羊来源抗体专用）

免疫组化常见十大问题与解析

图 1 实验流程与常见问题索引 Q1：染色结果呈阴性，是怎么回事？ （1）抗体来源选择错误：本试剂盒二抗为抗兔/鼠，请确保一抗来源的种属为兔源或鼠源。 （2）组织切片本身不存在目的蛋白：可通过 The Human Protein Atlas 数据库或 UniProt数据库查询目的蛋白在细胞或组织中的表达情况。 （3）抗体浓度和质量问题：提高抗体工作浓度或延长孵育时间；确认抗体可进行IHC实验，通过非IHC实验排除抗体质量问题。 （4）脱蜡不完全：可根据切片上是否存在透明颗粒，判断是否存在脱蜡

一文理清免疫荧光实验流程和常见问题

一抗和二抗与非特异性位点结合。通透后用PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加山羊血清，室温封闭30min。常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或者是羊血清。从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。醛类固定的样品，在用一抗孵育前用含0.3M甘氨酸的封闭液进行封闭。 4. 一抗孵育 根据一抗说明书，按照适当比例用一抗稀释液稀释一抗，用吸水纸吸尽封闭液，每张玻片滴加稀释好的一抗并放入湿盒， 4℃孵育过夜。回收一抗，加入

免疫荧光实验指南

。 抗体孵育 吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿盒，4 ℃ 孵育过夜。 加荧光二抗： PBST 浸洗爬片 3 次，每次 3 min，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中 37℃ 孵育 1 h，PBST 浸洗爬片 3 次，每次 3 min。 注意：从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行。 固定拍照 复染核：滴加 DAPI 避光孵育 5 min，对标本进行染核，PBST 5 min×4 次洗去多余的 DAPI。 用吸水