葡萄糖摄取检测试剂盒(DTNB法)

碧云天的葡萄糖摄取检测试剂盒(DTNB法) (Glucose Uptake Assay Kit with DTNB)，又称葡萄糖摄入检测试剂盒(DTNB法)或DTNB法葡萄糖摄入检测试剂盒，是一种基于DTNB的显色反应，利用葡萄糖类似物D-2-脱氧葡萄糖的摄入和基于偶联酶促反应的生化方法，通过吸光度检测，简单、快速、高灵敏地用于细胞或组织葡萄糖摄取能力检测的试剂盒。

葡萄糖是生物体重要的能量来源和代谢中间产物。葡萄糖一方面是光合作用的主要产物，另一方面也是呼吸反应的主要底物。在呼吸反应中，葡萄糖通过一系列的酶促反应氧化生成二氧化碳和水，同时产生重要的能量分子ATP。葡萄糖代谢是将葡萄糖转化为能量的过程，是大多数生物体能量供应的主要来源，在细胞代谢和体内稳态维持中起着关键作用[1-3]。细胞摄取葡萄糖是一个重要的生理过程，其摄取能力的检测对于理解细胞生理、病理和治疗相关疾病具有重要意义。在生理与代谢研究领域，检测细胞摄取葡萄糖对于理解细胞的糖代谢和能量代谢具有重要价值；在糖尿病研究领域，检测细胞摄取葡萄糖能力常用于解析高血糖的原因以及评估胰岛素敏感性和胰岛素抵抗；在肿瘤研究领域，许多肿瘤细胞表现出异常的葡萄糖摄取，通过监测细胞摄取葡萄糖的变化，可以更好地了解肿瘤细胞糖代谢的异常情况，为肿瘤防治提供线索[4-6]。

本试剂盒的检测原理请参考图1。葡萄糖类似物D-2-脱氧葡萄糖(2-Deoxy-D-glucose, 2-DG)，与D-葡萄糖(D-glucose)结构相似，可被葡萄糖转运体摄取到细胞中，并被内源性己糖激酶(Hexokinase)代谢成2-脱氧-D-葡萄糖-6-磷酸(2-Deoxy-D-Glucose-6-phosphate, 2-DG6P)。由于2-DG6P不是磷酸葡萄糖异构酶的底物，无法异构化为果糖，导致糖酵解反应中断，2-DG6P在细胞内蓄积，与细胞的葡萄糖摄取水平成正比[7]。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(Glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PDH)可催化细胞中积累的2-DG6P转化为2-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸酯(6PDG) [8]，同时NADP+转化为NADPH，即图中的Step A。在谷胱甘肽还原酶(Glutathione reductase, GR)的作用下，氧化型谷胱甘肽(Glutathione oxidized, G SSG)和生成的NADPH反应生成还原型谷胱甘肽(Glutathione reduced, GSH)，GSH可以和生色底物DTNB反应产生黄色的TNB，即图中的Step B。TNB在412nm左右有最大吸收峰，通过检测反应体系中生成的TNB的吸光度以最终计算样品中2-DG6P的含量，进而间接反映2-DG的含量，从而检测出细胞对葡萄糖的摄取能力。

图1.碧云天葡萄糖摄取检测试剂盒(DTNB法) (S0556)检测原理图。

本试剂盒检测灵敏度高，线性范围宽，样品用量少。本试剂盒在样品体积为25µl时可以检测样品中浓度低达0.04μM 2-DG (1pmol)的摄入，在0.04-4μM (1-100pmol)浓度范围内有良好的线性关系。本试剂盒提供了2-DG代谢产物2-DG6P标准溶液，可以通过设置标准曲线(图2A)，从而计算出2-DG摄入量，即间接反映葡萄糖的摄取水平(图2B)。如果样品的葡萄糖摄取能力较强，也可以使用测定方法更加便捷但检测灵敏度相对较低的葡萄糖摄取检测试剂盒(WST-8法) (S0554)。

图2.碧云天葡萄糖摄取检测试剂盒(DTNB法) (S0556)对于2-DG6P标准品和HeLa细胞样品的检测效果。图A为本试剂盒对标准品2-DG6P的检测效果，图B为本试剂盒对油酸诱导后的HeLa细胞葡萄糖摄取能力的检测效果。油酸诱导后的96孔板培养的HeLa细胞参考本产品的使用说明，经无血清低糖培养液孵育过夜后，用KRPH Buffer孵育40分钟，再如图所示使用胰岛素(Insulin)或/和根皮素(Phloretin)进行预处理，再加入2-DG进行孵育，适当洗涤后最终用100µl Glucose Uptake Lysis Buffer制备细胞裂解液样品。25µl不同浓度的2-DG6P标准品和10倍稀释的细胞裂解液样品(标准品和样品均使用Glucose Uptake Assay Buffer配制或稀释)，加入20μl Reaction Mix反应工作液混匀后，37ºC避光孵育60分钟，再加入5μl Stop Buffer混匀后70ºC避光孵育60分钟，最后依次加入5μl GR Buffer、25μl Recycling Mix反应工作液和20μl DTNB工作液，并依次混匀，37ºC避光孵育40分钟，测定A412，2-DG6P标准品在0.04-4μM (1-100pmol)浓度范围内有良好的线性关系。I, Insulin，可增强葡萄糖摄入；P, Phloretin，可抑制葡萄糖摄取。实际检测数据会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

本试剂盒使用便捷，检测灵敏度高。相较于碧云天的同类产品葡萄糖摄取检测试剂盒(WST-8法) (S0554)，本试剂盒的检测过程相对复杂一些，但是检测灵敏度提高了约40倍，特别适用于葡萄糖摄入能力的高精度检测，以及微量样品或葡萄糖摄入能力较低的样品的检测。

本试剂盒应用范围广。本试剂盒可用于不同细胞组织样品的检测，不区分物种；不仅适合少量样品的检测，也非常适合高通量筛选(High-throughput screening)的自动化操作系统。

按照使用说明操作，用于96孔板检测细胞样品时或自备2-DG用于动物的组织样品检测时，本试剂盒小包装可以进行100次检测，中包装可以进行500次检测。

包装清单：

产品编号	产品名称	包装
S0556S-1	Glucose Uptake Lysis Buffer	15ml
S0556S-2	Glucose Uptake Assay Buffer	10ml
S0556S-3	KRPH Buffer	12ml
S0556S-4	Enzyme Solution A	500μl
S0556S-5	Reaction Mix	200μl
S0556S-6	Stop Buffer	600μl
S0556S-7	GR Buffer	600μl
S0556S-8	Recycling Mix	200μl
S0556S-9	Enzyme Solution B	200μl
S0556S-10	DTNB (10X)	220μl
S0556S-11	2-DG (10mM)	1ml
S0556S-12	2-DG6P Standard (1mM)	20μl
－	说明书	1份

 

产品编号	产品名称	包装
S0556M-1	Glucose Uptake Lysis Buffer	70ml
S0556M-2	Glucose Uptake Assay Buffer	50ml
S0556M-3	KRPH Buffer	60ml
S0556M-4	Enzyme Solution A	2.5ml
S0556M-5	Reaction Mix	1ml
S0556M-6	Stop Buffer	3ml
S0556M-7	GR Buffer	3ml
S0556M-8	Recycling Mix	1ml
S0556M-9	Enzyme Solution B	1ml
S0556M-10	DTNB (10X)	1.1ml
S0556M-11	2-DG (10mM)	5ml
S0556M-12	2-DG6P Standard (1mM)	60μl
－	说明书	1份

保存条件：

-20ºC保存，一年有效。其中DTNB (10X)须避光保存。

注意事项：

如拟进行活体动物特定组织的葡萄糖摄取检测，需要自备适量的2-脱氧葡萄糖(2-DG)，本试剂盒中提供的2-DG (10mM)仅能满足细胞实验的需要。推荐选购D-2-脱氧葡萄糖(≥99%, Reagent grade) (ST1024)。

经测试，本试剂盒相对稳定，检测所得的2-DG6P标准曲线的线性范围等通常和说明书中的描述一致，但是实际效果可能会因为实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，例如最高浓度点的数据偏低或不在线性范围内等，通常可以舍去异常点的数据，取在线性范围内的数据来拟合标准曲线。

Stop Buffer和GR Buffer有腐蚀性，操作时请小心，并确保有效防护以避免直接接触人体，并须注意避免腐蚀其它物品。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。