Mouse IFN-γ Precoated ELISPOT

| 试剂盒的存放
未开封试剂盒在 2℃~8℃可稳定保存 12 个月；开封后一次性用完。| 需自备的材料设备
+ RPMI-1640 基础培养基（需要添加双抗）+ 无血清培养基（完全培养基，即用型），推荐使用达优ELISPOT无血清培养基。
+ 货号 2210003 试剂盒无阳性刺激物，推荐使用达优阳性刺激物PHA或 PMA+Ionomycin。
+ 超净工作台
+ CO2细胞培养箱
+ 微量移液器及配套 Tip 头
+ 8 通道微量移液器
+ 0.5 mL，1.5 mL EP 管
+ 酶联斑点分析仪

| 检测操作
第一天：接种细胞，加入刺激物，培养（严格注意无菌操作）◉ 试剂配制
1. 阳性刺激物：现配现用；按标签重悬即为工作液。2. 无血清培养基：如果没有 ELISPOT 无血清培养基，可用含5%~10%胎牛血清的 RPMI-1640 培养基代替。◉ 操作步骤
1. 预包被板的活化：200 μL/well 加入RPMI-1640 培养基或者无血清培养基，室温静置 5~10 分钟后将其扣出。2. 加入细胞悬液：将调整好浓度的细胞悬液加入各实验孔，100 μL/well。
正对照孔：细胞浓度可采用 1×10
5 cells/well；负对照孔：细胞浓度由实验者根据实验自行调整，跟实验孔保持一致；
背景负对照：加入不含细胞的无血清培养基（或重悬细胞所用的培养基）；
实验孔：细胞浓度由实验者根据实验自行调整。3. 加入刺激物：10 μL/well，具体如下：正对照孔：加入工作浓度的阳性刺激物；负对照孔：不加阳性刺激物；
背景负对照孔：不加阳性刺激物；

实验孔：加入实验者自己的刺激物（用无血清培养基或者RPMI
1640 配制成 10×终浓度）。
4. 孵育：所有样品和刺激物加完后，盖好板盖。放入37℃，5%CO2培养箱静置培养 16~24 小时。孵育期间避免晃动，为防止蒸发，可根据实验室条件增加防蒸发措施。例如使用锡纸把板条包裹后进行孵育，包裹时需底部平整。
第二天：培养后操作（不再需要无菌操作）
◉ 试剂配制
1. 注意：各组分 1×工作液及显色液现配现用。2. Washing Buffer（50×）：用去离子水稀释（1∶50），制成1×Washing Buffer 工作液备用。
3. Dilution Buffer R（10×）：用 1×PBS 稀释（1∶9），制成1×Dilution Buffer R 工作液备用。
4. 生物素标记的抗体（Biotinylated Antibody）：用1×DilutionBuffer R 工作液稀释（1∶100），制成 1×Biotinylated Antibody工作液。
5. 酶联亲和素（Streptavidin-HRP）：用1×DilutionBuffer R工作液稀释（1∶100），制成 1×Streptavidin-HRP 工作液。6. AEC 显色液：在洁净的容器内将 AEC Dilution、AECSolutionⅠ(20×)、AEC Solution Ⅱ (20×)、AEC Solution Ⅲ(200×)按照180∶10∶10∶1 的比例混匀，即为工作液。可参见下表。AEC显色液工作液室温下的半衰期约 30 分钟，使用时现用现配。

总体积 AEC Dilution
AEC Solution
Ⅰ (20×)
AEC Solution
Ⅱ(20×)
AECSolutionⅢ(200×)1 mL 0.9 mL 50 μL 50 μL 5μL2 mL 1.8 mL 100 μL 100 μL 10μL3 mL 2.7 mL 150 μL 150 μL 15μL4 mL 3.6 mL 200 μL 200 μL 20μL5 mL 4.5 mL 250 μL 250 μL 25μL8 mL 7.2 mL 400 μL 400 μL 40μL10 mL 9 mL 500 μL 500 μL 50μL◉ 操作步骤
1. 裂解细胞：倾倒孔内细胞及培养基。加入冰冷的去离子水，200 μL/well，4℃冰箱放置 10 分钟低渗裂解细胞。2. 洗板：甩出孔内液体，加入 1×Washing Buffer 工作液，260 μL/well，停留 1 分钟后弃去孔内液体，重复六次，每一次在吸水纸上扣干。
3. 检测抗体孵育：将 1×Biotinylated Antibody 工作液加入各实验孔，100 μL/well。37℃孵育 1 小时。4. 洗板：重复步骤 2。
5. 酶联亲和素孵育：将 1×Streptavidin-HRP 工作液加入各实验孔，100 μL/well 37℃孵育 1 小时。
6. 洗板：甩出孔内液体，加入 1×Washing Buffer 工作液，260 μL/well，停留 1 分钟后弃去孔内液体，重复五次，每一次在吸水

纸上扣干，洗涤完成后揭开板底座，用去离子水/自来水洗涤膜底面及底座，用吸水纸小心吸干底座及膜底残留的水迹，合上底座，加入1×Washing Buffer 工作液，260 μL/well，停留1 分钟后弃去孔内液体，彻底扣干孔内液体。
7. 显色：将现配的 AEC 显色液加入各实验孔，100 μL/well。室温避光静置 5~30 分钟，根据斑点生成情况选择终止显色时间。若室温低于 20℃，建议在 37℃孵箱做显色，每隔5~10 分钟检查一次。8. 终止显色：倾倒孔内液体，揭开板底座，用去离子水/自来水洗涤各实验孔正反面及底座 3~5 遍，终止显色。将板放置在室温阴凉处，待其自然晾干后合上底座。
9. ELISPOT 板斑点计数，并记录斑点的各种参数，做统计分析。| 洗涤指导
用排枪每孔加入 260 μL 洗涤缓冲液。加入洗涤缓冲液之后浸泡1分钟，然后扣出洗涤缓冲液。
注意：所有从孔中移出液体的步骤均需用力甩出或者扣出，勿用枪头去吸，以免碰刮、损伤到膜。洗涤步骤的最后一次操作需要在吸水纸上拍干。吸水纸最好采用进口棉纸，强度高，不掉屑，吸水量大，使用前需要高压灭菌。不充分的洗涤将加重膜背景，对斑点计数造成干扰。

| 注意事项及提示性说明
1. Washing Buffer(50×) 4℃存放后出现结晶析出为正常现象，用前半小时置于 37℃轻摇混匀可消除结晶，对实验结果无影响。2. Dilution Buffer R(10×)有少量沉淀为正常的蛋白饱和析出，用前静置沉降，取用上清即可，不影响实验结果。
3. AEC 底物的使用：AEC 底物现用现配，颠倒混匀，并在半个小时内使用；避免使用聚苯乙烯（PS）材料的容器盛放；若正常使用试剂发生析出，加样过程中，间隔性混匀试剂，轻微析出不影响实验结果，同时注意避光。4. 试剂盒恢复室温所使用的样品来源于人体，所有的样品都应考虑到潜在的感染危险。对所有样品及其成分的处理、使用、储存和放置都应遵守国家的有关规定。
5. 试剂中含有生物防腐剂，可能导致皮肤过敏。使用时应避免接触皮肤，操作时佩戴合适的手套。
6. 显色底物溶液对眼睛、呼吸系统和皮肤有刺激。呼吸吸入、皮肤接触或口腔摄入有害。使用时应避免吸入蒸汽和喷射物，避免皮肤和眼睛接触，应使用合适的防护服、眼镜和采取皮肤保护设施。