大鼠转基因模型

大鼠转基因模型

1. 构建方法

1.1 原核显微注射法

原理：通过显微注射技术将外源基因注入大鼠受精卵的原核中，使其整合到宿主基因组中。

步骤：

受精卵收集：从大鼠卵巢中收集受精卵。

显微注射：将线性化的外源基因（如EGFP）注入受精卵的原核中。

胚胎移植：将注射后的受精卵移植到代孕大鼠的子宫中。

后代筛选：通过荧光显微镜筛选携带外源基因的后代。

特点：该方法是经典的转基因技术，但成功率较低，通常只有2%左右。

1.2 睡眠美人转座子介导法

原理：利用睡眠美人转座子系统将外源基因插入大鼠基因组中，提高基因整合效率。

步骤：

转座子构建：将外源基因插入到睡眠美人转座子载体中。

显微注射：将转座子载体和转座酶mRNA共同注入受精卵的原核中。

胚胎移植：将注射后的受精卵移植到代孕大鼠的子宫中。

后代筛选：通过PCR等方法筛选携带外源基因的后代。

特点：该方法可提高转基因的成功率，但存在基因沉默的风险。

1.3 睾丸注射与电穿孔法

原理：通过睾丸注射和电穿孔技术将外源基因直接整合到大鼠精原干细胞的基因组中。

步骤：

DNA准备：将线性化的外源基因（如EGFP）准备成1 μg/μl的溶液。

睾丸注射：将30-35 μl的DNA溶液注入40±2天大的Wistar雄性大鼠睾丸的三个不同位置。

电穿孔：使用8个90V的方波脉冲（每个脉冲0.05秒，间隔约1秒）进行电穿孔。

后代筛选：将电穿孔后的雄性大鼠与野生型雌性大鼠交配，通过荧光显微镜筛选携带外源基因的后代。

特点：该方法操作简便，成功率高，可达33.08%，且可在10-15分钟内完成。