Avian Leukosis Virus(ALV)禽白血病病

Avian Leukosis Virus(ALV)禽白血病病毒H亚群染料法荧光定量RT-PCR试剂盒

一、PCR 试剂盒的核心原理

变性：高温（94-95℃）使双链 DNA 解旋为单链；

退火：低温（50-65℃）使引物与模板 DNA 特异性结合；

延伸：中温（72℃左右）由 DNA 聚合酶催化 dNTP 沿模板链合成新 DNA 链。
循环 30-40 次后，目标 DNA 片段可扩增数百万倍，便于检测或分析。

二、PCR 试剂盒的主要分类

1. 普通 PCR 试剂盒

特点：用于定性检测目标 DNA（如病原体核酸、基因片段），需通过琼脂糖凝胶电泳观察结果。

典型应用：

科研领域：基因克隆、突变检测；

临床检测：细菌 / 病毒（如新冠病毒、HPV）的初步筛查。

2. 荧光定量 PCR（qPCR）试剂盒

特点：通过荧光染料（如 SYBR Green）或探针（如 TaqMan）实时监测扩增过程，实现定量分析（绝对定量或相对定量）。

典型应用：

病毒载量检测（如 HIV、HBV）；

基因表达分析（如 mRNA 定量）；

肿瘤微小残留病灶（MRD）监测。

3. 实时荧光定量 PCR 试剂盒（含探针法）

特点：探针与目标序列特异性结合，荧光信号仅在扩增时释放，特异性更高，可区分单碱基突变。

典型应用：

遗传病诊断（如地中海贫血）；

耐药基因检测（如结核fen枝杆菌耐药突变）。

4. 逆转录 PCR（RT-PCR）试剂盒

特点：包含逆转录酶，可将 RNA 逆转录为 cDNA 后再进行 PCR，用于检测 RNA 病毒（如新冠病毒）或基因表达（mRNA）。

操作流程：

逆转录阶段：RNA→cDNA；

PCR 阶段：扩增 cDNA。

5. 多重 PCR 试剂盒

特点：在同一反应体系中加入多对引物，同时扩增多个目标片段，提高检测效率。

典型应用：

病原微生物多重检测（如呼吸道病毒 panel）；

肿瘤多基因分型（如乳腺癌相关基因）。

6. 高分辨率熔解（HRM）PCR 试剂盒

特点：通过检测 DNA 熔解曲线分析序列变异（如 SNP、甲基化），无需电泳。

典型应用：

基因突变筛查；

病原体分型（如 HPV 型别鉴定）。

三、PCR 试剂盒的组成

不同类型试剂盒组分略有差异，但通常包含以下核心试剂：

四、PCR 试剂盒操作流程（以普通 PCR 为例）

准备反应体系：

按试剂盒说明书配制混合液（含酶、引物、dNTP、缓冲液）；

加入模板 DNA（或 cDNA）及对照（阳性 / 阴性）。

设置 PCR 程序：

预变性（95℃，3-5 分钟）：激活酶并彻底解链模板；

循环反应（变性→退火→延伸，30-40 次）；

终延伸（72℃，5-10 分钟）：确保产物完整。

结果检测：

普通 PCR：琼脂糖凝胶电泳后，通过 EB 或 SYBR Green 染色观察条带；

qPCR：直接读取荧光信号，生成扩增曲线和熔解曲线。

五、PCR 试剂盒的应用场景

医学检测：

病原体诊断（如新冠、结核、淋球菌）；

肿瘤基因检测（如 EGFR 突变指导靶向治疗）；

遗传病筛查（如囊性纤维化、唐氏综合征）。

科研领域：

基因克隆与表达分析；

进化生物学（物种鉴定、亲缘关系分析）；

转基因检测（如作物外源基因筛查）。

法医鉴定：

DNA 指纹图谱（犯罪现场样本比对）。

农业与食品：

种子纯度检测、转基因成分筛查、微生物污染检测。

六、注意事项

污染控制：

分区操作：设样本制备区、试剂配制区、扩增区，避免气溶胶污染；

使用 UNG 酶（尿嘧啶 - N - 糖基化酶）降解残留的扩增产物（dUTP 替代 dTTP）。

试剂保存：

酶、引物、探针等需低温（-20℃或 - 80℃）保存，避免反复冻融；

缓冲液和 dNTP 可短期存放于 4℃。

样本质量：

核酸提取需纯净，避免蛋白、酚类、金属离子等抑制酶活性；

RNA 样本需注意防降解（使用 RNase 抑制剂）。

参数优化：

退火温度：通过梯度 PCR 确定最佳退火温度（通常为引物 Tm 值 - 5℃）；

镁离子浓度：影响酶活性和特异性，可通过预实验调整（一般 1.5-3.0 mM）。

安全防护：

处理病原体样本时需戴手套、口罩，在生物安全柜中操作；

废弃试剂按生物危害物处理，避免环境污染。

七、常见问题与解决方案

八、选购建议

明确需求：根据检测目的（定性 / 定量）、样本类型（DNA/RNA）选择对应试剂盒；

品牌与认证：优先选择通过 NMPA（中国）、CE（欧盟）等认证的临床级试剂盒；

性能验证：关注灵敏度（最低检测限）、特异性（交叉反应率）、批间一致性等指标；

配套服务：选择提供技术支持（如实验优化、结果分析）的供应商。