Human CRBN Ligand Screening As

   人cereblon (CRBN) 蛋白配体结合检测试剂盒采用均相时间分辨荧光技术（TR-FRET），可用于CRBN抑制剂或配体的结合检测和筛选，是实现快速检测CRBN抑制剂或配体的高通量筛选形式，基本原理如下图所示。
   Eu标记的链霉亲和素（Streptavidin-Eu）特异识别结合生物素标记的CRBN/DDB1蛋白，受体标记的沙利度胺（Thalidomide-Ac）与CRBN结合，使Eu和Ac靠近，在外部光源的激发下，供体与受体之间发生能量共振转移，检测665nm波长的信号强度即可测定CRBN/DDB1与Thalidomide-Ac的结合。反应体系中加入的CRBN配体或PROTAC会竞争结合CEBN/DDB1，使信号降低，配体或PROTAC浓度升高，信号降低。该均相实验操作简单，无需洗涤步骤。

组分	浓度	500T	2500T	10000T
Thalidomide	10 mM in DMSO	5μL	25μL	100μL
Biotin-CRBN/DDB1	100X	25μL	125μL	500μL
Thalidomide-Ac	100X	25μL	125μL	500μL
Streptavidin-Eu	50X	50μL	250μL	1mL
检测缓冲液	10X	1.2mL	5.5mL	21mL

*使用前将试剂冰上融化，平衡至室温。
*所有试剂工作液现用现配。

一.反应体系

如下表所示，反应体积为20μL，在384微孔板中进行。

名称	用量 (μL)
标准品或待测样品	5
Biotin-CRBN/DDB1	5
Thalidomide-Ac	5
Streptavidin-Eu	5
总体积	20

二.试剂准备

（1）缓冲液准备
用ddH2O稀释检测缓冲液至1X。
（2）标准品或待测样品配制
使用稀释至1X的检测缓冲液进行待测样品和标准品的配制。若样品的储液为DMSO，建议保持体系中DMSO 含量一致，且最高不超过2%。试剂盒中Thalidomide 标准品为10mM DMSO 母液。请根据实验情况配制标准品总量，以下内容仅供参考。

Standard	配置方法	配制浓度	终浓度（nM）
Std10	1 μL标准品母液+ 82.3μL检测缓冲液	12000.00	30000
Std9	10 μL std 10 + 20 μL 检测缓冲液(含1.2% DMSO)	40000	10000
Std8	10 μL std 9 + 20 μL 检测缓冲液(含1.2% DMSO)	13333.3	3333.33
Std7	10 μL std 8 + 20 μL 检测缓冲液(含1.2% DMSO)	4444.4	1111.11
Std6	10 μL std 7 + 20 μL 检测缓冲液(含1.2% DMSO)	1481.5	370.37
Std5	10 μL std 6 + 20 μL 检测缓冲液(含1.2% DMSO)	493.8	123.46
Std4	10 μL std 5 + 20 μL 检测缓冲液(含1.2% DMSO)	164.6	41.15
Std3	10 μL std 4 + 20 μL 检测缓冲液(含1.2% DMSO)	54.9	13.72
Std2	10 μL std 3 + 20 μL 检测缓冲液(含1.2% DMSO)	18.3	4.57
Std1	10 μL std 2 + 20 μL 检测缓冲液(含1.2% DMSO)	6.1	1.52
Std0	20μL 检测缓冲液	0	0

（3）蛋白配制
Biotin-CRBN/DDB1的母液为100X, 使用1X检测缓冲液100倍稀释后，每孔加样5μL， 例如，将2μL Biotin-CRBN/DDB11母液加入到198 μL 1X检测缓冲液中，即为200μL蛋白工作液。
（4）Thalidomide-Ac配置
Thalidomide-Ac母液浓度为100X，使用1X检测缓冲液100倍稀释后，每孔加样5μL， 例如，将2 μL Thalidomide-Ac母液加入到198 μL 1X检测缓冲液中，即为200μL工作液。
（5）检测试剂配制
Streptavidin-Eu母液浓度为50X，使用1X检测缓冲液100倍稀释后，每孔加样5μL， 例如，将2 μL Streptavidin-Eu母液加入到98 μL 1X检测缓冲液中，即为100μL工作液。

三.实验流程

将试剂配制后，轻柔混匀备用，按照下表进行加样。

	标准品	待测样品	阴性对照
Step1	5μL稀释后的标准品	5μL待测样品(4X)	5μL检测缓冲液
Step2	5 μL Biotin-CRBN/DDB1		5 μL检测缓冲液
Step3	封板混匀后，室温孵育30min
Step4	5 μL Thalidomide-Ac
Step5	5 μL Streptavidin-Eu
Step6	封板混匀后，室温孵育120min，读板

*孵育时用封板膜封板，防止试剂蒸发。

四.数据处理

计算每个孔位的受体和供体的发射信号的比值：
Ratio=（Signal 665nm/Signal 620nm）×10⁴
计算CV（%）：CV（%）=Ratio Deviation/Mean Ratio×100%

（1）标准曲线*
由图表可知，由于Thalidomide标准品与Thalidomide-Ac竞争与CRBN/DDB1的结合，使信号值降低。

储存方法：-80°C保存。
试剂应避免反复冻融，建议首次解冻后进行分装，按保存条件保存，有效期一年。