琥珀酸检测试剂盒（比色法）

琥珀酸比色法测试盒;Succinic Acid Colorimetric Assay Kit

琥珀酸通过酶试剂催化下与显色剂生成有颜色的物质在波长 555 nm 处有最大吸收，通过测定 555 nm 处的 OD 值大小和标准曲线可以计算样本中琥珀酸含量。

编号	名称	规格（96T））	储存
试剂一(Reagent 1)	缓冲液 A(Buffer Solution A)	50mL	-20℃，6个月
试剂二(Reagent 2)	缓冲液 B(Buffer Solution B)	50mL	-20℃，6个月
试剂三(Reagent 3)	底物(Substrate)	粉末×2	-20℃，避光，6个月
试剂四(Reagent 4)	促进剂(Accelerant)	粉末×2	-20℃，避光，6个月
试剂五(Reagent 5)	酶试剂 A(Enzyme Reagent A)	0.5mL	-20℃，避光，6个月
试剂六(Reagent 6)	酶试剂 B(Enzyme Reagent B)	1.5mL	-20℃，避光，6个月
试剂七(Reagent 7)	显色剂(Chromogenic Agent)	5mL	-20℃，避光，6个月
试剂八(Reagent 8)	4 mmol/L 标准品溶液 (4 mmol/L Standard Solution)	1mL	-20℃，避光，6个月
	96 孔酶标板	1板
	96 孔覆膜	2张
	样本位置标记表	1张

说明：
1、试剂严格按上表中的保存条件保存，不同测试盒中的试剂不能混用。

本试剂盒适用于检测血清(浆)、动物组织及细胞样本中的琥珀酸的含量。

血清（浆）；动物组织;细胞

0.043-0.5 mmol/L

一、所需自备物品：
仪器：酶标仪(550-560 nm，最佳检测波长 555 nm)、37°C 恒温箱
耗材：10 KD 超滤管
二、试剂准备：
1、检测前，试剂盒中的试剂平衡至25℃。
2、试剂三工作液的配制：
      取一支试剂三加入0.5 mL试剂一混匀溶解，置于冰上避光待用，未使用完的-20℃避光保存，2天内使用有效。
3、试剂四工作液的配制：
      取一支试剂四加入1.5 mL试剂二混匀溶解，置于冰上避光待用，未使用完的-20℃避光保存，2天内使用有效。
4、试剂五工作液的配制：
      将试剂一：试剂五按体积比=9：1配制，置于冰上避光待用，现配现用，1天内使用有效。
5、测定工作液的配制：
      将试剂一：试剂三工作液按体积比= 14：1配制，置于冰上避光待用，现配现用，1天内使用有效。
6、显色工作液的配制：
      将试剂二：试剂四工作液：试剂六：试剂七按体积比=26：2：2：6配制，在加入测定工作液至板孔后的孵育阶段进行配制，置于冰上避光待用。30 min内使用有效。
7、0.5 mmol/L标准品的配制：
      将双蒸水：试剂八按体积比=7：1配制，避光待用，现配现用，一天内使用有效。
8、不同浓度标准品的稀释：

编号	1	2	3	4	5	6	7	8
标准品浓度(mmol/L)	0	0.10	0.15	0.20	0.30	0.35	0.40	0.50
0.5 mmol/L 标准品(μL)	0	40	60	80	120	140	160	200
双蒸水(μL)	200	160	140	120	80	60	40	0

三、样本准备：
1、样本处理
      血清(浆)样本：取100-500 μL上清，加入到10 KD超滤管，12000 × g 离心15 min，取外管滤出液待测。
      组织样本:按照组织样本质量(g)：双蒸水体积(mL)=1：9的比例匀浆，4℃，10000 × g离心10 min。取100-500 μL上清，加入到10 KD超滤管，12000 × g 离心15 min，取外管滤出液待测。
      细胞样本：取1×10^6个细胞，加入200 μL双蒸水匀浆处理细胞。4℃，10000 × g离心10 min。取上清，加入到10 KD超滤管，12000 × g 离心15min，取外管滤出液待测。
2、样本的稀释在正式检测前，需选择2-3个预期差异大的样本稀释成不同浓度进行预实验，根据预实验的结果，结合本试剂盒的线性范围：0.043-0.5 mmol/L，请参考下表稀释(仅供参考)：

样本	稀释倍数	样本	稀释倍数
10%小鼠肝组织	不稀释	人血清	不稀释
10%小鼠肾组织	不稀释	1×10^6 个 Molt-4 细胞	不稀释
10%大鼠肝组织	不稀释	1×10^6 个 HL-60 细胞	不稀释
10%大鼠心组织	不稀释	1×10^6 个 Jurkat 细胞	不稀释
10%大鼠肺组织	不稀释	1×10^6 个 Hela 细胞	不稀释

注：稀释液为双蒸水。
四、操作步骤：
1、标准孔：取 20 μL 不同浓度标准品溶液，分别加入相应的酶标孔中；
     测定孔：取 20 μL 待测样本加入相应的酶标孔中；
     对照孔：取 20 μL 待测样本加入相应的酶标孔中。
2、向步骤1中标准孔和测定孔加入 30 μL 试剂五工作液；
      向步骤1中对照孔加入 30 μL 试剂一。
3、 向步骤2中各孔加入 80 μL 测定工作液。
4、振板 5 s，37°C 避光孵育 5 min。
5、向4中各孔加入 120 μL 显色工作液。
6、振板 5 s，37°C 避光孵育 15 min，酶标仪 555 nm 波长下检测各孔OD 值。
五、操作表：

	标准孔	测定孔	对照孔
不同浓度的标准品溶液(μL)	20	—	—
待测样本(μL)	—	20	20
试剂五工作液(μL)	30	30	—
试剂一(μL)	—	—	30
测定工作液(μL)	80	80	80
振板 5 s，37°C 避光孵育 5 min
显色工作液(μL)	120	120	120
振板 5 s，37°C 避光孵育 15 min，酶标仪 555 nm 波长下检测各孔 OD 值。

六、结果计算：
标准品拟合曲线：y = ax + b
1、血清（浆）中琥珀酸含量计算公式：

2、组织样本中琥珀酸含量计算公式：

3、细胞样本中琥珀酸含量计算公式：

注解:
y：标准品 OD 值-空白 OD 值(标准品浓度为 0 时的 OD 值)
x：标准品的浓度
a：标曲的斜率
b：标曲的截距
∆A₅₅₅：A _测定 – A _对照
f：样本加入检测体系前的稀释倍数
m：组织湿重质量，g
n：细胞样本数量，10^6
V：样本匀浆液体积，mL
七、 标准曲线(数据仅供参考)
1、不同浓度标准品加样量20 μL，按照操作步骤进行实验，OD值如下表所示：

标准品浓度(mmol/L)	0	0.10	0.150	0.20	0.30	0.35	0.40	0.50
OD 值	0.405	0.496	0.548	0.598	0.684	0.733	0.797	0.884
	0.390	0.501	0.538	0.587	0.705	0.725	0.798	0.884
平均 OD 值	0.398	0.499	0.543	0.593	0.695	0.729	0.798	0.884
绝对 OD 值	0.000	0.101	0.146	0.195	0.297	0.332	0.400	0.487

2、绘制标曲(如下图)：

-20°C，避光，有效期6个月。