Human BCL-XL/VHL PROTAC Bindin

【检测原理】

试剂盒采用均相时间分辨荧光技术（TR-FRET），用于测定分子胶 BCL-XL DEGRADER-2 及待检测化合物介导的 VHL 复合体与 BCL-XL 相互作用。该方法是实现简单快速的检测能够介导 VHL 复合体与 BCL-XL 相互作用的小分子的高通量形式。

如所示，VHL 和 BCL-XL 之间的相互作用是通过使用Eu标记的抗Tag1抗体（TR-FRET 供体）和 Accepter 标记的抗 Tag2 抗体（TR-FRET受体）检测的。由于分子胶 BCL-XL DEGRADER-2 介导了 VHL 与 BCL-XL 的相互作用，供体抗体与受体抗体接近，供体抗体的激发会触发向受体抗体的荧光共振能量转移（FRET），使受体抗体特异性发射665nm波长的信号。该特定信号与 BCL-XL DEGRADER-2  和 VHL、BCL-XL 的相互作用的程度成正比。该均相实验操作简单，无需洗涤步骤。

组分	浓度	500T	保存温度
Tag1-VHL protein,34x	30x	67uL	-80℃
Tag2- BCL-XL protein	320x	6.5uL	-80℃
BCL-XL DEGRADER-2	5mM	10uL	-80℃
Anti-Tag1 Eu cryptate antibody	50x	50uL	-80℃
Anti-Tag2 Ac antibody	100x	25uL	-80℃
Detection buffer	10x	2mL	-80℃

1. 试剂准备
使用前将所有试剂室温融化（室温平衡至少30min）。384浅孔板反应体系为20uL（反应体系试剂用量如表所示），在配制之前计算实验所需体积，按需配制；以下配制仅供参考，以500次为例。

试剂名称	用量（uL）
Tag1-VHL protein,34x	4
Tag2- BCL-XL protein	4
BCL-XL DEGRADER-2	2
Anti-Tag1 Eu cryptate antibody，	5
Anti-Tag2 Ac antibody	5
Total	20

1.1 缓冲液（1x）配制 1.2mL Detection buffer （10x）中 加入10.8mL无菌水，混匀备用  
1.2 Tag1-VHL protein工作液配制 取67uL Tag1-VHL protein 原液，加入 1x 缓冲液 1.9mL, 混匀备用  
1.3 Tag2- BCL-XL protein工作液配制 取6.5uL Tag2- BCL-XL protein原液，加入 1x 缓冲液 2mL, 混匀备用  
1.4 Anti-Tag1 Eu cryptate antibody工作液配制 取50uL Anti-Tag1 Eu cryptate antibody 原液，加入 1x 缓冲液 2.45mL, 混匀备用  
1.5 Anti-Tag2 Ac antibody工作液配制 取25uL Anti-Tag2 Ac antibody 原液，加入 1x 缓冲液 2.5mL, 混匀备用  
1.6 Mix-1配制 Anti-Tag1 Eu cryptate antibody和Anti-Tag2 Ac antibody分别稀释后1:1混匀备用  
1.7 BCL-XL DEGRADER-2 或待检测化合物配制 按照反应体系，BCL-XL DEGRADER-2 或待检测化合物应用Detection buffer稀释至体系终浓度的10倍。例如体系终浓度为150nM, 应稀释浓度为1500nM。同时稀释相同百分含量的DMSO作为阴性对照孔，每孔用量2uL  

2. 加样及对照
2.1 实验孔加样顺序：4uL Tag1-VHL protein，4uL L Tag2- BCL-XL protein，2uL BCL-XL DEGRADER-2 或待检测化合物，10uL混匀的Mix-1，依次加入384浅孔板中。
2.2 阴性对照孔（Blank）： BCL-XL DEGRADER-2 或待检测化合物替换为2uL相同百分含量的DMSO溶液。
2.3 质控孔：15uL 1x 缓冲液加5uL稀释后的Anti-Tag1 Eu cryptate antibody。  

3. 检测 用封板膜封住板孔，室温孵育2h。在兼容TR-FRET的酶标仪上检测（激发光为320nm，检测620nm和665nm的发射波长）。  
【结果计算】

1. 计算信号值：665nm荧光信号比620nm荧光信号再乘以10000，即信号值= (665/620)*10000

1. 根据信号值计算δ值：

δ值= (Std-NC)/NC*100 3.计算CV（%） CV（%）= Standard Deviation/Mean Ratio×100%

【数据示例】 以下数据不能代替实验中获得的数据，只作为示例，结果可能因TR-FRET兼容仪器而异。
 

BCL-XL DEGRADER-2 ,nM	Ratio	CV (%)	δ值
150	1684.50	1.9%	1881.9
75.0	1634.00	1.0%	1822.4
37.50	1527.50	4.3%	1696.9
18.75	1167.50	17.7%	1274.1
9.38	800.50	1.2%	841.7
4.69	472.85	6.9%	456.4
2.34	303.85	0.6%	257.5
1.17	224.35	6.5%	164.0
0.59	178.90	2.8%	110.5
0.29	166.90	4.7%	96.4
0 (DMSO)	103.80	0.1%	22.1
Eu only	85.00	0.4%