TR-FRET Kinase-TK Assay Kit

TR-FRET Kinase-TK Assay Kit是一种采用均相时间分辨荧光技术（TR-FRET）测定酪氨酸激酶活性的通用方法，适用于多种酪氨酸激酶的活性检测及抑制剂筛选，该方法操作简单。
如下图所示，检测方法包括酶促反应和检测两个步骤。在酶促反应过程中，体系成分包括激酶、生物素化底物以及ATP，加入ATP后，激酶将生物素化的TK底物磷酸化。在检测步骤中，用检测缓冲液稀释检测试剂，缓冲液中的EDTA将酶促反应终止，供体Eu标记的抗体和受体标记的链霉亲和素同时捕获被磷酸化的底物，结合在底物上的两种检测试剂产生的TR-FRET信号与底物磷酸化水平成正比，即与体系中激酶的磷酸化活性成正比。

组分	浓度	200T	500T	2000T	20000T
生物素化底物	1.3mM	2uL	5uL	20uL	200uL
ATP	10mM	20uL	50uL	200uL	2mL
受体标记链霉亲和素	1mg/mL	5uL	12.5uL	50uL	500uL
Eu标记抗体	70×	15uL	38uL	150uL	1.5mL
酶促缓冲液	5×	0.5mL	1.25mL	5mL	50mL
检测缓冲液	1×	2mL	5mL	20mL	200mL

以384浅孔板为例
需自备试剂：
激酶，ddH₂O，DTT， MgCl₂，MnCl₂

一、试剂配制
各种组分工作液配制后不建议保存，必须立即使用，为了避免降解，激酶工作液在实验过程中应保存在冰上。
1、激酶缓冲液1×：用ddH₂O将5× 酶促缓冲液稀释至1×，添加DTT，MgCl₂，MnCl₂配置成1× 激酶缓冲液。注：推荐添加浓度1mM DTT，5mM MgCl₂，5mM MnCl₂。具体的金属离子及浓度需要根据不同的激酶进行调整。
2、检测缓冲液：提供1×工作液。
3、抑制剂：用1×激酶缓冲液稀释化合物，稀释为酶促步骤（10uL）所需终浓度的2.5倍的工作溶液。
4、激酶：用1×激酶缓冲液稀释，配置浓度为165nM的工作液（酶促步骤终浓度33nM）。
5、生物素化底物：用1×激酶缓冲液稀释生物素化底物原液，配置酶促步骤（10uL）所需浓度浓度5倍的工作液。建议浓度1uM，配置浓度为5uM的工作液。
6、ATP：用1×激酶缓冲液稀释ATP原液，配置酶促步骤（10uL）所需浓度浓度5倍的工作液，建议酶促步骤终浓度100uM。
7、受体标记链霉亲和素：用1×检测缓冲液稀释受体标记链霉亲和素，建议配置浓度为稀释200倍至5ug/mL（终浓度1.25ug/mL），受体标记链霉亲和素的用量可根据实际情况进行优化。
8、Eu标记抗体：用1×检测缓冲液按照稀释倍数稀释至1×即为工作液。

二、操作步骤

组分	实验孔	阴性对照	Eu标记抗体对照	缓冲液对照
抑制剂/激酶缓冲液	4uL	6uL 激酶缓冲液	10uL 激酶缓冲液	10uL 激酶缓冲液
激酶	2uL	2uL	--	--
生物素化底物	2uL	--	--	--
ATP	2uL	2uL	--	--
酶促反应（10uL）：37℃孵育1h。
生物素化底物	5uL	5uL	--	--
Eu标记抗体	5uL	5uL	5uL	--
检测缓冲液	--	--	5uL	10uL
检测步骤：室温孵育1h后，上机。

注：
1、抑制剂在酶促反应步骤添加，建议将抑制剂与激酶分别添加后在37℃孵育15min，加入底物和ATP，酶促反应体系中，建议DMSO浓度不高于2%。
2、阴性对照：非特异性信号，用于计算反应体系的特异性信号值。
3、缓冲液对照：排除缓冲液对信号值的影响。
4、Eu标记抗体对照：用于验证Eu标记抗体在620nM的正常信号值。


三、检测
在兼容的TR-FRET酶标仪上检测（激发光为320nm，检测620nm和665nm的发射波长）。

四、结果计算
1、计算每个孔位的受体和供体的发射信号的比值
比值 =（Signal 665nm/Signal 620nm）*10000。
2、计算每个孔的受体和供体发射信号的增量比
Net signal = [Ratio(实验孔)- Ratio(阴性对照孔)]/ Ratio(阴性对照孔)*100
3、计算变异系数CV%（复孔检测时，计算复孔之间的变异系数）
CV% = 标准差/平均值*100%。

五、示例数据
以下示例仅用于参考，具体实验体系应根据具体情况进行调整优化。
1、底物滴定
示例的激酶是EGFR，酶促反应步骤中，EGFR终浓度100nM，生物素化底物终浓度从1uM进行三倍稀释至12.3nM，ATP终浓度100uM，孵育1h后加入检测试剂室温孵育1小时，上机读板。可以发现，TR-FRET信号值与反应体系中的底物浓度成正比。
3、ATP滴定
根据以上结果，酶促反应体系中EGFR终浓度为33nM，生物素化底物终浓度为1uM ，ATP终浓度最高200uM进行3倍梯度稀释至5nM。孵育1h后加入检测试剂室温孵育1h，上机读板。