Optimal 8培养基

产品描述

Optimal 8培养基(简称O8培养基)是厦门逸漠生物科技有限公司研发技术团队开发的一种适用于无饲养层培养、专为人胚胎干细胞(hESC)和人诱导多能干细胞 (hiPSC) 的生长和扩增而配制的无血清培养基，无动物源成分，化学成分明确。O8培养基已被用于扩大 hESC/iPSC 的生产，并被证明可以支持hESC(H1) 生长 >30 代，且没有任何分化迹象，同时保持分化三胚层的能力。

O8可与本公司铺板工作液配合使用，进行hESC/hiPSC的扩增与建库。

产品规格

1 Kit，2℃~-20℃储存

产品信息

1. 传代条件：① 细胞汇合度达 70%左右(如图 3(B-D)所示)，一般情况下每 3-4 天传 代;

② 细胞汇合度较低，生长密度分布不均匀。

注：即使克隆团较小、汇合度不足，也建议不要连续培养超过 5 天。

2.传代比例：可根据细胞生长状态和实验需要按 1:5~1:12 的比例进行传代，如果细胞正 常，克隆团汇合度 85%，大小均匀(如图 3(B-D)所示)，建议按照 1:8 进行传代，如果密度 偏低，则可降低传代比例;密度偏高，则增加传代比例。

注：1:8 传代就是 1 个孔传 8 个孔(以6 孔板为例)。

3. 将 Laminin521 包被的 6 孔板，hESC/iPSC Passage Solution(Enzyme containing)，DPBS 提前放置生物安全柜 中约 1 小时恢复至室温(~25℃)。

4. 根据传代接种的孔数准备 2 mL/孔的 O8完全培养基，加入 iPS Y27632 终浓度为 10μM，恢复至室温(~25℃)。

5. 将细胞六孔板孔内培养基吸弃，加入 1 mL/孔的 DPBS(不含钙镁)，轻轻摇晃后吸弃。

6. 加入 1 mL/孔的 hESC/iPSC Passage Solution(Enzyme containing)，使溶液完全覆盖孔底。

7. 置于 37℃培养箱中孵育 7-9 min。

注：① 消化 7-8 min 后镜下观察细胞变化，当大部分细胞变亮变圆，且细胞尚未脱离基 质，若大部分细胞仍未变亮，则需要延长消化时间，不超过 10min;

② 保持 6 孔板与培养箱金属隔板直接接触，使 6 孔板受热均匀，不要叠放。

8.消化时吸取 6 孔板中的 Laminin521溶液，加入预温的 O8 培养基+ iPS Y27632 2 mL/孔。

9.消化结束后轻轻地将细胞培养板拿回生物安全柜，避免震荡摇晃细胞，倾斜并吸除 hESC/iPSC Passage Solution(Enzyme containing)。吸取 1 mL/孔预温的O8 完全培养基+ iPS Y27632，将细胞吹下来。

注：① 吸取 O8 培养基 + iPS Y27632 吹打细胞时，轻柔吹打，不能超过 2 次，避免反复吹打;有部分细胞(10%～15%)未脱离基质是正常现象，若有大量细胞未脱离则需延长消化时间(< 10min)。

10.把这一毫升细胞悬液悬空滴加入板里的培养基，每孔 3-5 滴。在 6 孔板上标记细胞名 称、代次、传代比例、日期、操作人，水平十字摇匀 3 次。

注：可将传完代后的细胞在镜下观察细胞密度，根据密度调整是否需要多加细胞滴;如操作时间较久，应及时把细胞悬液移至离心管中，避免细胞再次贴壁。

11.置于37℃,5% CO2 浓度，饱和湿度的培养箱中，再次水平十字摇匀 3 次，不要叠放。

12. 18-24 小时后换新的 O8 培养基，此后每天换液，第 4 天继续传代/冻存。 注：传代后隔天算第 1 天。

冻存 hESC/iPSC

1. 当细胞汇合度达 70%左右(如图 3(B-D)所示)可收获冻存，一般 6 孔板每孔可冻 存 1 管。

2. 准备相应数量的 1.5/2 mL 冻存管，标记细胞名称、代次(P#)、日期、操作人。

3. 取出 4℃冰箱中的 hESC/iPSC Cryopreservation Solution ，使用前注意摇匀，吸取所需用量(1mL/孔)，加入 iPS Y27632，使终浓度为 10μM。

4. 吸取上清液，加入 2 mL/孔的 DPBS(不含钙镁)，轻轻摇晃数次，再吸取。

5. 加入 1 mL/孔的 hESC/iPSC Passage Solution(Enzyme containing)，将细胞置于 37℃培养箱中，计时 7-9 min(可 参考“六、传代 hESC/iPSC”步骤)。

6. 消化结束，轻轻取出培养板，吸取 hESC/iPSC Passage Solution(Enzyme containing)。

7. 吸取 1mL hESC/iPSC Cryopreservation Solution ，轻柔吹打1-2次，随后吸取细胞悬液加入 1.5/2 mL 冻存管中。

8. 将细胞置于梯度程序降温盒中，并置-80℃冰箱中过夜，次日转入液氮罐中长期保存。

其他培养体系中 hESC/iPSC 更换为 O8完全培养基条件的适应

其他无饲养层条件培养的 hESC/iPSC 可以在细胞状态良好时，使用原培养基进行细胞传代，24 小时后更换成混合培养基(原培养基与O8培养基按照 1:1 混合)培养，培养 2 代后完全换成 O8培养基培养，培养 2-3 代后可完全适应新的培养体系，此时可进行细胞冻存处理。