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Rosa26-EYFP(CD4/EYFP)小鼠脾细胞中观察到,未经处理的活细胞EYFP荧光信号最强;然而,使用FoxP3染色试剂盒(含Fix/Perm和Perm两步法)后,EYFP荧光几乎完全消失。值得注意的是,若在标准染色流程前先用2%多聚甲醛(PFA)进行预固定,则EYFP信号可有效保留。 这一现象表明,荧光丢失并非源于荧光蛋白的化学降解,而是由于Fix/Perm缓冲液固定能力不足,导致可溶性胞质EYFP在后续破膜和洗涤步骤中被被动洗脱出细胞。 怎样解决
物。一般SP三步法二抗选择Biotin标记的二抗,以与后面的SP结合反应;而免疫荧光染色就需要购买不同荧光素标记的二抗,如罗丹明、FITC、Cy3等常用荧光素。这主要与后面有无三抗和三抗种类有关。(3)选择IgM还是IgG。一般一抗是IgM,那么二抗就选择IgM;反之,一抗是IgG,则二抗选择IgG。(4)生产厂家。一般SP三步法我们实验室选择中杉金桥的二抗染色试剂盒,内含有工作液的二抗,故试验中只需摸索一抗的浓度即可,效果还可以;而免疫荧光的二抗我一般选择Jackson ImmnoResearch公司
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