Amplex Red草酰乙酸检测试剂盒

碧云天研发的Amplex Red草酰乙酸检测试剂盒(Amplex Red Oxaloacetate Assay Kit，简称Amplex Red OAA Assay Kit)是一种基于探针Amplex Red，利用荧光或吸光度检测，快速、高灵敏地对血清、血浆、尿液等生物体液、组织、细胞以及组织或细胞培养上清样品中草酰乙酸与草酰乙酸盐含量进行检测的试剂盒。通常0.5-2µl血清或血浆样品就足够用于本试剂盒的荧光法检测。

草酰乙酸(Oxalacetic acid, OAA)，是一种三羧酸循环(Tricarboxylic acid cycle, TCA)代谢中间产物，与乙酰辅酶A反应生成柠檬酸，其分子式为C4H4O5，分子量为132.07。草酰乙酸可以由转氨酶催化天冬氨酸脱氨产生或者由丙 酮酸羧化酶催化丙 酮酸与CO2而产生。草酰乙酸参与糖异生、尿素循环、乙醛酸循环、氨基酸合成、脂肪酸合成和柠檬酸循环。草酰乙酸的缺乏会限制糖异生和尿素循环功能，并可导致能量缺乏。草酰乙酸也可用作血液中的谷氨酸盐清除剂，在外伤性脑损伤后提供神经保护，表现为海马体神经元损失减少和神经结果的改善[1]。

草酰乙酸作为三羧酸循环的重要组成部分，细胞内草酰乙酸的含量决定着三羧酸循环的速度。草酰乙酸主要来源于糖代谢中的丙 酮酸羧化，因此糖代谢障碍时，三羧酸循环及脂质的分解代谢将不能顺利进行；草酰乙酸也是糖异生途径的重要代谢物；草酰乙酸还参与了乙酰辅酶A从线粒体转运至胞浆及胞浆内NADH转运至线粒体的过程。草酰乙酸可经转氨基作用合成天冬氨酸，也可以在胞浆中转化成丙 酮酸后彻底氧化分解为二氧化碳和水。此外，草酰乙酸还与氨基酸代谢和核苷酸代谢有关。总之，草酰乙酸在生命活动中发挥着重要的作用，其含量检测对于疾病的监测和防治有着重要的意义[2]。

本试剂盒中的Amplex Red是一种对H2O2高度敏感的荧光探针。在辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase, HRP)存在的情况下，Amplex Red能与H2O2 1:1反应，产生强烈的红色荧光物质试卤灵(Resorufin)。试卤灵的最大激发波长为571nm，最大发射波长为585nm，并且在激发波长处有很强的可见光吸收。因此本试剂盒可以用吸光度和荧光两种方法来进行检测。

本试剂盒的检测原理请参考图1。草酰乙酸(Oxalacetic acid, OAA)首先在草酸脱羧酶(Oxalate decarboxylase, OXDC)的催化作用下脱羧形成丙 酮酸(Pyruvic acid)和二氧化碳。生成的丙 酮酸在丙 酮酸氧化酶(Pyruvate oxidase, PO)的作用下和氧气发生氧化反应生成乙酰磷酸(Acetyl phosphate)、CO2和H2O2，再通过检测H2O2与Amplex Red的反应产物试卤灵(Resorufin)的荧光强度或吸光度来最终计算样品中草酰乙酸的含量。试卤灵的荧光强度或吸光度与样品中草酰乙酸的含量成正比。

图1.碧云天Amplex Red草酰乙酸检测试剂盒(S0339)检测原理图。

本试剂盒检测灵敏度高，线性范围宽，样品用量少。本试剂盒在样品体积为20µl时，采用吸光度检测可以检测浓度低至20μM的草酰乙酸，在20-1000μM浓度范围内有良好的线性关系；采用荧光检测可以检测浓度低至2μM的草酰乙酸，在2-200μM浓度范围内有良好的线性关系。荧光检测的灵敏度比吸光度检测高约10倍，可以使用更少量的样品。本试剂盒提供了草酰乙酸标准溶液，可以通过绘制标准曲线(图2)，计算出样品中的草酰乙酸含量。

图2.碧云天Amplex Red草酰乙酸检测试剂盒(S0339)检测草酰乙酸标准品的标准曲线。20µl各浓度的草酰乙酸标准品和80µl Amplex Red反应工作液混匀后，37ºC避光反应30分钟，进行吸光度和荧光检测。左图为吸光度检测，右图为荧光检测。本试剂盒采用吸光度检测时，在20-1000µM浓度范围内有良好的线性关系；采用荧光检测时，在2-200µM浓度范围内有良好的线性关系。实际检测数据会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

本试剂盒检测方法灵活，检测速度快。本试剂盒既可以进行荧光检测，也可进行吸光度检测。整个检测过程约30分钟即可完成。

本试剂盒提供的检测裂解液有一定的通用性。使用本试剂盒中的BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay裂解获得的细胞或组织样品，也可以用于碧云天生产的其它代谢类试剂盒中同样使用BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay进行裂解的样品检测，通用性强；而且还可用于检测蛋白浓度、进行SDS-PAGE或一些较易溶解蛋白的Western检测。

本试剂盒应用范围广。本试剂盒可用于小鼠、大鼠、人等的血清、血浆、尿液等生物体液，细胞培养上清、组织或细胞样品等的检测。本试剂盒不仅适合少量样本的检测，也非常适合高通量筛选(High-throughput screening)的自动化操作系统。

按照使用说明操作，用于96孔板检测时，本试剂盒小包装可以进行100次检测。

包装清单：

产品编号	产品名称	包装
S0339S-1	BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay	20ml
S0339S-2	Oxaloacetate Assay Buffer	20ml
S0339S-3	Amplex Red	200µl
S0339S-4	Enzyme Solution A	200μl
S0339S-5	Enzyme Solution B	200μl
S0339S-6	Cofactor	200μl
S0339S-7	Oxaloacetate Standard (10mM)	200μl
－	说明书	1份

保存条件：

-20ºC保存，一年有效。其中Amplex Red和Cofactor须避光保存。

注意事项：

Amplex Red在空气中不太稳定，开启后应尽快使用，且在使用过程中需注意适当避光。

Amplex Red的反应产物在还原剂的存在下会很不稳定，因此最终反应体系中的二硫苏糖醇(DTT)、β-巯基乙醇或类似还原剂的浓度应低于10µM。

请确保反应体系的pH值在7-8之间，否则会影响Amplex Red的稳定性和荧光值。

Amplex Red和Oxaloacetate Assay Buffer需要完全解冻并平衡至室温后再使用，否则会影响检测结果。其它各种溶液使用时应在冰上进行。

经测试，本试剂盒相对稳定，检测所得的草酰乙酸标准曲线的线性范围等通常和说明书中的描述一致，但是实际效果可能会因为实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，例如最高浓度点的数据偏低或不在线性范围内等，通常可以舍去高浓度异常点的数据，取在线性范围内的数据来拟合标准曲线。

为减少稀释液产生的荧光背景带来的误差，样品和标准品的稀释液应该根据样品的种类来定。当样品为BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay制备的细胞或组织的裂解样品时，应使用BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay稀释，当样品为血液等其它样品时，宜使用Oxaloacetate Assay Buffer稀释。

血清、血浆等样品如果在4ºC保存，保存的时间不得超过2周，否则会影响检测结果的准确性。通常血清样品宜在-20ºC保存，-80ºC保存更佳。

荧光酶标仪检测时须使用适合荧光检测的黑板或白板，推荐使用碧云天BeyoGold™全黑96孔细胞培养板(平底带盖, 独立包装) (FCP966)或BeyoGold™黑色透明底96孔细胞培养板(平底带盖, 独立包装) (FCP965)。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。