Amplex Red琥珀酸检测试剂盒

碧云天研发的Amplex Red琥珀酸检测试剂盒(Amplex Red Succinate Assay Kit)，是一种基于探针Amplex Red，利用荧光或吸光度检测，快速、高灵敏地对血清、血浆和尿液等生物体液、组织或细胞样品以及组织或细胞培养上清等样品中琥珀酸与琥珀酸盐含量进行检测的试剂盒。通常0.2-2μl血清或血浆样品就足够用于本试剂盒的检测。

琥珀酸(Succinic acid or Amber acid)，又称丁二酸，亚乙基丁二酸，分子式为C4H6O4，分子量为118.09。琥珀酸是一种二羧酸，能发生二元酸的大多数典型反应，由于分子中含有两个活泼的亚甲基，因此又具有许多其它的重要反应特性，如酯化、氯化、碘化等。琥珀酸在食品、医药、化工、环保等行业都有着非常广泛的应用。

琥珀酸是三羧酸循环(Tricarboxylic acid cycle, TAC)的关键代谢中间产物，同时也是厌氧代谢的发酵产物之一。在生物体中，琥珀酸通常以阴离子的形式存在，即琥珀酸盐。作为一种代谢中间产物，琥珀酸被参与制造ATP的电子传递链的复合物中的琥珀酸脱氢酶(Succinate dehydrogenase, SDH)转化为延胡索酸(Fumarate) [1]。琥珀酸通过三羧酸循环在线粒体中产生，可以离开线粒体基质并在细胞质和细胞外空间发挥作用，还可以改变基因表达模式，调节表观遗传或进行激素样信号传导。因此，琥珀酸可以将细胞代谢，尤其是ATP形成与细胞功能的调节联系起来。一些遗传性线粒体疾病如Leigh综合征和Melas综合征，都会发生琥珀酸合成失调，进而导致ATP合成失调，可导致恶性转化、炎症和组织损伤等病理状况[2]。

本试剂盒中的Amplex Red是一种对H2O2高度敏感的荧光探针。在辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase, HRP)存在的情况下，Amplex Red能与H2O2 1:1反应，产生强烈的红色荧光物质试卤灵(Resorufin)。试卤灵的最大激发波长为571nm，最大发射波长为585nm，并且在激发波长处有很强的可见光吸收。因此本试剂盒可以用荧光和吸光度两种方法来进行检测。

本试剂盒的检测原理请参考图1。琥珀酸在琥珀酰辅酶A合成酶(Succinyl-CoA synthetase, SCS)的作用下与ATP和辅酶A (Coenzyme A, CoA)反应生成琥珀酰辅酶A (Succinyl-CoA)和二磷酸腺苷(Adenosine diphosphate, ADP)，生成的ADP在丙 酮 酸激酶(Pyruvate kinase, PK)的催化作用下与磷酸烯醇式丙 酮酸(Phosphoenolpyruvate, PEP)反应产生丙 酮酸(Pyruvic acid)和ATP。在一些辅助因子存在的条件下，生成的丙 酮酸在丙 酮酸氧化酶(Pyruvate oxidase, PO)的催化作用下和氧气发生氧化反应生成乙酰磷酸(Acetyl phosphate)、CO2和H2O2，再通过检测H2O2与Amplex Red的反应产物试卤灵(Resorufin)的荧光强度或吸光度来最终检测琥珀酸的含量。试卤灵的荧光强度或吸光度与样品中琥珀酸的含量成正比。

图1.碧云天Amplex Red琥珀酸检测试剂盒(S0529)检测原理图。

本试剂盒检测灵敏度高，线性范围宽，样品用量少。本试剂盒在样品体积为20µl时，采用吸光度检测可以检测浓度低至20μM的琥珀酸，在20μM-500μM (0.4-10nmol)浓度范围内有良好的线性关系；用荧光检测可以检测浓度低至2μM的琥珀酸，在2μM-200μM (0.04-4nmol)浓度范围内有良好的线性关系。使用本试剂盒进行荧光法检测时，检测灵敏度会显著提高，可以使用更少量的样品。本试剂盒提供了琥珀酸标准溶液，可以通过设置标准曲线(图2)，计算出样品中的琥珀酸含量。

图2.碧云天Amplex Red琥珀酸检测试剂盒(S0529)检测琥珀酸标准品的标准曲线。20µl各浓度的琥珀酸标准品和80µl Amplex Red反应工作液混匀后，37ºC避光反应30分钟，进行吸光度和荧光检测。左图为吸光度检测，右图为荧光检测。本试剂盒采用吸光度检测时，在20-500µM浓度范围内有良好的线性关系；采用荧光检测时，在2-200µM浓度范围内有良好的线性关系。实际检测数据会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

本试剂盒检测方法灵活，检测速度快。本试剂盒既可以进行荧光检测，也可进行吸光度检测，荧光检测比吸光度检测灵敏度约高10倍。整个检测过程约60分钟即可完成。

本试剂盒提供的检测裂解液有一定的通用性。使用本试剂盒中的BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay裂解获得的细胞或组织样品，也可以用于碧云天生产的其它代谢类试剂盒中同样使用BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay进行裂解的样品检测，通用性强；而且还可用于检测蛋白浓度、进行SDS-PAGE或一些较易溶解蛋白的Western检测。

本试剂盒适用范围广。本试剂盒可用于小鼠、大鼠、人等的血清、血浆、尿液等生物体液，细胞培养上清、组织或细胞样品等的检测。本试剂盒不仅适合少量样本的检测，也非常适合高通量筛选(High-throughput screening)的自动化操作系统。

按照使用说明操作，用于96孔板检测时，本试剂盒小包装可以进行100次检测。

包装清单：

产品编号	产品名称	包装
S0529S-1	BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay	20ml
S0529S-2	琥珀酸检测缓冲液	20ml
S0529S-3	Amplex Red	200μl
S0529S-4	酶溶液A	200μl
S0529S-5	酶溶液B	200μl
S0529S-6	辅助因子	200μl
S0529S-7	底物	200μl
S0529S-8	琥珀酸标准溶液(10mM)	200μl
－	说明书	1份

保存条件：

-20ºC保存，一年有效。其中Amplex Red、酶溶液B和辅助因子须避光保存。

注意事项：

Amplex Red在空气中不太稳定，开启后应尽快使用，且在使用过程中需注意适当避光。

Amplex Red的反应产物在还原剂的存在下会很不稳定，因此最终反应体系中的二硫苏糖醇(DTT)、β-巯基乙醇或类似还原剂的浓度应低于10µM。

请确保反应体系的pH值在7-8之间，否则会影响Amplex Red的稳定性和荧光值。

Amplex Red和琥珀酸检测缓冲液(后续简称检测缓冲液)需完全解冻并平衡至室温后再使用，否则会影响检测结果。其它溶液使用时应在冰上进行。

经测试，本试剂盒相对稳定，检测所得的琥珀酸标准曲线的线性范围等通常和说明书中的描述一致，但是实际效果可能会因为实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，例如最高浓度点的数据偏低或不在线性范围内等，通常可以舍去高浓度异常点的数据，取在线性范围内的数据来拟合标准曲线。

为减少稀释液产生的荧光背景带来的误差，样品和标准品的稀释液应该根据样品类型来确定。当样品为BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay制备的细胞或组织的裂解样品时，应使用BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay稀释，当样品为血液等其它样品时，宜使用检测缓冲液稀释。

血清等样品如在4ºC保存，保存时间不得超过2周，否则会影响检测结果的准确性。通常血清样品宜-20ºC保存，-80ºC保存更佳。

荧光酶标仪检测时须使用适合荧光检测的黑板或白板，推荐使用碧云天BeyoGold™全黑96孔细胞培养板(平底带盖, 独立包装) (FCP966)或BeyoGold™黑色透明底96孔细胞培养板(平底带盖, 独立包装) (FCP965)。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。