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文献和实验/mL 和 AAV/腺病毒的 vg/GC 混用,导致 MOI 和用量算错一个数量级。 AAV 表达框超 4.7kb 会怎样?直接包装失败或滴度极低,应换短启动子、去标签、双载体或改慢病毒。 荧光弱是不是病毒就废了?多数情况不是,常是 MOI 偏低或检测时间窗没到,先用对照病毒确认感染条件。 为什么必须做预实验?正式打目的病毒前用带荧光对照病毒摸 MOI 和感染条件,能避免效率低、荧光弱且找不到原因。 病毒反复冻融有什么后果?滴度会断崖式下跌、病毒失活,应分装保存并严格按温度储存运输。 如果要找
Co-IP总是拉不下来?裂解液、抗体、磁珠与洗涤全流程调参指南
可以按照: 看Input → 检查裂解液 → 检查IP抗体 → 匹配Protein A/G → 调整孵育条件 → 优化洗涤强度,逐步进行。 Co-IP没有一套适合所有蛋白互作的固定参数。真正需要优化的,是在目标蛋白能够稳定富集、非特异背景可控,同时尽可能保留原有蛋白复合物的条件下完成检测。 参考资料: 1.Thermo Fisher Scientific. Co-Immunoprecipitation (Co-IP). 2.Thermo Fisher Scientific. Protein IP, Co-IP
: 1. 感受态种类与效率,尤其转化效率,一定要很高。效率越高转化成攻率越高。有的时候片段与载体已经连接成功了,只不过在转化时,自身空间结构较大,没有转进去。 2. 酶切反应:如果可以,请用thermo fisher的内切酶,无论单酶切还是双酶切,6 h足够了。takara的酶批次间稳定性经常有问题,而且长时间酶切,片段很容易切碎。 3. 4000+的片段先加A连接到T载体上,利用片段两端的酶切位点双切,回收后再连接载体。 4. 如果第3步还是不行,请尝试一下这个偏方
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