谷氨酰胺酶2(GLS2)重组蛋白

酵母蛋白酶的问题

问：请问各位高手，我想让酵母蛋白酶Ａ失活，决定采用ＰＣＲ进行ＤＮＡ序列的突变，此法行的通吗？可有前人研究过？ 答：国外有了"蛋白酶缺失"的用于重组蛋白表达的菌株。国内也许也有，小龙对于上游不大懂，不知道自己构建蛋白酶缺失的酵母菌是否有技术上的难度。参见一篇综述《生命的化学》2003 年23 卷1 期CHEMISTRY OF L IFE 2003，23(1) 酵母表达系统及其应用研究。 假如只是为了降低重组蛋白表达时被水解的可能，在提取液中加入蛋白酶抑制剂如PMSF可以部分解决。

重组蛋白制备工艺优化策略

成分。5.优化表达条件（1）重组蛋白不表达或者表达量低。如果重组蛋白不表达（包含体和可溶蛋白都没有）通过改变诱导剂浓度，诱导温度，时间等都不表达的时候，然后尝试更换菌株、质粒载体。降低诱导后培养温度。重组蛋白表达得越慢，其折叠效果就越好，大肠杆菌在4℃时依然可以表达重组蛋白，而将培养温度降低至25-30℃就能显著改善蛋白折叠。此方法不适用于温度诱导的重组蛋白表达；减少诱导剂。诱导剂浓度可以降低至1/10；选用Lac渗透酶缺陷型菌株，如Tuner、Rosetta等，也有很好的效果。这类菌株能够使进入每个细胞

蛋白复性（二）-基因重组蛋白质的体外复性

蛋白、含二硫键蛋白在体外成功复性。 包涵体形成的原因 重组蛋白在宿主系统中高水平表达时，无论是原核表达体系或真核表达体系甚至高等真核表达体系，都会形成包涵体[2]。主要因为在重组蛋白的表达过程中，缺乏某些蛋白质折叠过程中需要的酶和辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的[3]。 1、 表达量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确配对，过多的蛋白间的非特异