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- 2025年07月15日
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免疫荧光单标双色扫描全套（切片）
服务介绍：
抗原抗体的结合非常特异。免疫荧光单标是用与目标蛋白对应的特异性的第一抗体去孵育组织切片，然后再利用对应的带有荧光染料的第二抗体与第一抗体结合，在组织切片扫描仪或者荧光显微镜下用荧光染料对应波长的光去激发染料发出荧光进而将目标蛋白通过间接标记的方式显示出来。也可以利用TSA技术进行荧光标记，有信号放大的作用。TSA技术主要原理为用HRP标记的第二抗体与第一抗体结合后，再孵育荧光标记的酪胺（TSA），TSA在二抗上偶联的HRP与H2O2的作用下变为活化的酪胺并附着在目标蛋白周围的蛋白酪-氨酸残基上，在组织切片扫描仪或者荧光显微镜下用荧光染料对应波长的光去激发染料发出荧光进而将目标蛋白通过间接标记的方式显示出来。利用TSA技术也可进行多种蛋白同时标记，每轮标记都按一抗-二抗-TSA的顺序对相应抗原进行标记，每轮染色只需改变TSA荧光染料种类即可实现多个靶标用不同荧光染料进行共同标记。
切片数字扫描是通过控制显微成像系统和切片以一定的规则运动，采集多张连续的高分辨率显微图像再无缝拼接生成一张高分辨率的组织切片全景图像。该图像包含了玻片上所有的信息，可在电脑上用浏览软件任意放大和缩小，任意部位观察采图，是真正脱离显微镜的阅片方式。通过在扫描仪上加载与免疫标记时荧光染料匹配的最佳激发波长和发射波长的滤光块，获取不同荧光通道的图像。可单通道，多通道任意组合浏览并按需采图。
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名称 |
规格 |
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免疫荧光单标双色扫描全套（切片） （包含免疫荧光染色和扫描） |
张 |
送样运输要求：
1、组织样本放置于10倍样本体积的通用型组织固定液中固定24h以上，常温保存运输石蜡包埋切片或者冰冻切片。置于固定液内的组织切勿冷冻结冰，切勿固定时间过长。细胞爬片用通用型组织固定液固定，封口膜封好防止漏液，常温保存运输。
2、石蜡切片常温保存运输。冰冻切片-20°保存运输。
实验大体流程：
荧光二抗法：
石蜡切片脱蜡至水（冰冻切片和细胞爬片无需此步）——微波抗原修复——画圈血清封闭——孵育一抗——孵育荧光二抗（可根据需求选择不同荧光染料标记的二抗）——DAPI染核——自发荧光淬灭——抗荧光淬灭封片剂封片——扫描全景成像。
TSA法
石蜡切片脱蜡至水（冰冻切片和细胞爬片无需此步）——微波抗原修复——画圈双-氧水封闭——血清封闭——孵育一抗——孵育HRP二抗——孵育TSA（可根据需求选择不同荧光染料标记的TSA）——DAPI染核——自发荧光淬灭——抗荧光淬灭封片剂封片——扫描全景成像。
荧光二抗法实验具体流程：
1、石蜡切片脱蜡至水：依次将石蜡切片放入环保型脱蜡液I 10min-环保型脱蜡液II 10min-环保型脱蜡液III 10min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-无水乙醇Ⅲ 5min-蒸馏水洗。
2、抗原修复：组织切片置于盛满抗原修复缓冲液（ PH 6.0 柠檬酸； PH 9.0 EDTA； PH 8.0 EDTA）的抗原修复盒中于微波炉内进行抗原修复。维持缓冲液沸腾10min左右，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PH7.4 PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min(修复液种类和修复条件根据组织来确定，优先推荐 PH 6.0 柠檬酸修复液）。
3、画圈血清封闭：切片稍甩干后用免疫组化笔在组织周围画圈（防止试剂流走），切片平放于透明湿盒滴加血清室温封闭30min。一抗是山羊来源用10%兔血清封闭，一抗其它来源的用3%BSA封闭。
4、加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加用无菌PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于透明湿盒内4°C孵育过夜（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）。
5、加对应种属荧光素标记的二抗（常用iF488标记的二抗或CY3标记的二抗）：将玻片置于PH7.4 PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后平放于透明湿盒在圈内滴加与一抗相应种属的荧光素标记的二抗覆盖组织，室温孵育50min。
6、DAPI复染细胞核：切片稍甩干后将切片平放于避光湿盒在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。将玻片置于PH7.4 PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
7、自发荧光淬灭：切片稍甩干后将切片平放于避光湿盒在圈内加入自发荧光淬灭剂5min，流水冲洗10min。
8、封片：将玻片置于PH7.4 PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。
9、镜检成像：切片置于玻片数字扫描仪下扫描全景成像。各种荧光素颜色及激发与发射波长见下表。
TSA法实验具体流程：
1、石蜡切片脱蜡至水：依次将石蜡切片放入环保型脱蜡液I 10min-环保型脱蜡液II 10min-环保型脱蜡液III 10min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-无水乙醇Ⅲ 5min-蒸馏水洗。
2、抗原修复：组织切片置于盛满抗原修复缓冲液（ PH 6.0 柠檬酸； PH 9.0 EDTA； PH 8.0 EDTA）的抗原修复盒中于微波炉内进行抗原修复。维持缓冲液沸腾10min左右，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PH7.4 PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min(修复液种类和修复条件根据组织来确定）。
3、画圈, 双-氧水封闭：切片稍甩干后用免疫组化笔在组织周围画圈（防止试剂流走），切片平放于避光湿盒滴加3%双-氧水溶液，室温避光孵育25 min左右，封闭内源性过氧化物酶。将玻片置于PH7.4 PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
4、血清封闭:切片平放于透明湿盒滴加血清室温封闭30min。一抗是山羊来源用10%兔血清封闭，一抗其它来源的用3%BSA封闭。
5、加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加用无菌PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于透明湿盒内4°C孵育过夜（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）。
6、加对应种属HRP标记二抗：将玻片置于PH7.4 PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后平放于透明湿盒在圈内滴加与一抗相应种属的HRP标记的二抗覆盖组织，室温孵育50min。
7、加TSA（常用iF488-TSA或iF555-TSA）：将玻片置于PH7.4 PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后将切片平放于避光湿盒在圈内滴加iF555-TSA，避光室温孵育10min。 孵育完后，将玻片置于TBST中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
8、DAPI复染细胞核：切片稍甩干后将切片平放于避光湿盒在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。将玻片置于PH7.4 PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
9、自发荧光淬灭：切片稍甩干后将切片平放于避光湿盒在圈内加入自发荧光淬灭剂5min，流水冲洗10min。
10、封片：将玻片置于PH7.4 PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。
11、镜检成像：切片置于玻片数字扫描仪下扫描全景成像。
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文献和实验免疫荧光单标双色扫描全套（切片）
光定量表达。 Ⅰ、Ⅲ型胶原以红、绿双色荧光通道扫描观察，绿色荧光的激发波长为488nm，在；30nm波长以上观察，红色荧光的激发波长为543nm，在；60nm波长以上观察。每张切片选取10个视野观察，并由计算机自带扫描分析软件测定荧光强度与荧光面积。上述指标的荧光值＝平均荧光强度×平均荧光面积。研究结果显示：经FITC和TRITC免疫荧光双重染色的Ⅲ型胶原阳性表达为绿色荧光；I型胶原阳性表达为红色荧光。慢性肝炎、肝硬化患者Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达大量增加，在门管区、血管壁周围及炎性坏死区均可见到I、Ⅲ型胶原表达增加
-rat-Tex-Red（红）。 2、我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要自我摸索，我感觉一抗 4℃ 孵育过夜比较好，背景比较清晰。 3、我的阳性对照采用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的 IgG，荧光标记物对照是 PBS+ 荧光标记物。 4、封闭血清是二抗来源动物的正常血清，我用的是 10% 正常 donkey 血清。 5、其余事项同免疫荧光单标操作。
）可提高敏感性。最后，通过确定由多个操作人员和/或使用不同抗体批次进行的研究是否提供可比较的结果来确定可重复性[1]。 2. 多重荧光免疫组化检测方法的开发和优化 a 首先使用单标免疫组化和免疫荧光优化 首先开发单标测定，以初步了解染色参数，包括组织处理/固定参数、抗原检索条件（ pH 值和温度）、基于已知阳性对照的亚细胞定位和染色模式、抗体和检测试剂滴定以及其他孵育和封闭条件。单标免疫组化是此步骤的首选起始方法，除非用户以前具有免疫荧光（IF）的经验[2]。 建立 IHC
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