非洲猪瘟病毒（P72/CD2v/MGF）三重荧光PCR检测试

通用名称：非洲猪瘟病毒（P72/CD2v/MGF）三重荧光PCR检测试剂盒

【包装规格】  50T/盒

【预期用途】
非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒（P72+CD2v+ MGF+IC）采用实时荧光PCR技术扩增ASFV的P72基因、CD2v基因和MGF基因，用于检测疑似感染动物的血液，淋巴结、脾脏、肌肉、肺脏等样品以及口腔液、环境样品中的非洲猪瘟病毒核酸。同时针对猪源DNA设计了内参，对整个检测过程进行质控。本试剂盒为四重实时荧光PCR，适用于非洲猪瘟病毒常规监测、生物安全防护的应用，也可用于流行株与CD2v基因、MGF基因缺失株感染的鉴别诊断。

 

【检测原理】
 非洲猪瘟病毒荧光PCR 检测试剂盒（P72+CD2v+MGF+IC）利用实时荧光PCR 技术，以非洲猪瘟病毒基因组的P72基因、CD2v 基因和MGF 基因为靶区域，设计特异性引物及探针，通过检测荧光信号，鉴别样品中的非洲猪瘟病毒的流行株与缺失株。同时，本试剂盒针对猪DNA 设计了内参对整个检测过程进行质控。

 

【使用方法】

一、试剂准备（在试剂准备区进行）

1. 取出包装盒中的各组分，室温放置，待其完全融化，混匀后备用。

2. 根据待测样本、阴性对照、阳性对照的数量，按下表1单反应体系配制方法，取相应量的试剂，充分混匀成PCR-Mix，按照20 μL/反应分装到PCR反应管中，瞬时离心后备用。

表1：单反应体系配制方法

试剂	反应液	混合酶
用量	19 μL	1 μL

二、样本准备（在样本准备区进行）

1. 使用商品化的病毒核酸提取试剂盒，参照说明书进行操作，提取好的核酸样本如不能立即检测，建议-70℃以下保存。

2. 取出样本后混匀，将阴性对照、待测样本、阳性对照各5 μL加入到PCR反应管中混匀。

3. 盖上管盖，2000 rpm离心30秒。

4. 将PCR反应管转移到扩增区进行上机。

三、PCR（在核酸扩增区进行）

1. 将上述PCR反应管按照实验布局依次放入PCR仪对应检测孔内，并记录顺序。

2. 按表2设置PCR扩增循环参数。

表2：PCR扩增相关参数

体系		反应体系设为25 μL
信号采集		选择FAM通道检测H5亚型； 选择CY5通道检测H7亚型； 选择ROX通道检测H9亚型。
PCR 反应 条件	阶段	条件	循环数
	逆转录	50℃：30 min	1
	预变性	95℃：5 min	1
	PCR	95℃：15 sec	45
		60℃：30 sec （此阶段结束时采集荧光信号）

 

【结果分析】

表3：结果分析表

实验成立 条件	阴性对照	三通道Ct＞38或者No Ct，线形为直线或轻微斜线，无指数增长期。
	阳性对照	三通道Ct≤30且出现典型的S型扩增曲线。
样本结果 判定标准	H5亚型 阳性	FAM通道Ct≤35且出现典型的S型扩增曲线。
	H7亚型 阳性	CY5通道Ct≤35且出现典型的S型扩增曲线。
	H9亚型 阳性	ROX通道Ct≤35且出现典型的S型扩增曲线。

 

结果可疑	任一通道35＜Ct≤38，建议复测，复测结果仍为可疑，且出现明显指数增长，判为阳性。否则为阴性。
结果阴性	Ct＞38或者No Ct，线形为直线或轻微斜线，无指数增长期。

 

 

【注意事项】

1. 使用本试剂盒的实验室，应严格按照国家有关基因扩增检验实验室管理规范进行管理。

2. 各区域物品均为专用，不得交叉使用，以免污染。检测结束后，应立即对工作台进行清洁消毒。

3. 吸取反应液时，应尽量避免产生气泡。上机前，应注意检查各反应管是否盖紧，以免液体蒸发造成结果不准确。

4. 检测过程中使用过的吸头，应直接打到盛有10%次氯酸的废液缸内，检测结束的PCR反应管，切忌开盖，并与其他废弃物品一同灭菌后丢弃。

5. 工作台及各种实验用品应定期用10%次氯酸、75%酒精或紫外灯进行消毒。

6. 试剂使用前应在常温下充分融化并混匀。不同批号的试剂请勿混用，并在有效期内使用。

 

【储存条件与有效期】

试剂盒应置于-20℃冷冻避光贮存；

试剂盒保存有效期为12个月；

试剂盒反复冻融次数不宜超过5次。