荧光定量PCR Premix试剂盒(Taqman)

荧光定量PCR Premix试剂盒(Taqman)是一种用于实时荧光定量PCR实验的试剂盒，它结合了PCR扩增技术和荧光信号检测技术，能够实现对特定序列DNA的定量分析。以下是对该试剂盒的详细介绍：

一、产品概述

荧光定量PCR Premix试剂盒(Taqman)提供了进行简便、灵敏的荧光PCR检测的完整系统。该试剂盒包含了经过优化的缓冲液、dNTP、热启动Taq DNA聚合酶混合物以及MgCl2溶液，形成了一个即时可用的混合物。用户无需再花费时间去混合试剂，同时确保了结果的一致性和可重复性。

二、产品特点

1. 高灵敏度：采用Taqman探针技术，能够在低拷贝数的模板DNA下获得可靠的荧光信号。
2. 高特异性：基于引物和探针的双重特异性，能够准确检测目标核酸序列。
3. 操作简便：试剂盒预混合了所有必要的反应成分，用户只需按照说明书添加引物、探针和模板即可开始实验。
4. 结果可靠：通过实时荧光PCR仪监测荧光信号变化，可以绘制出荧光定量曲线，并进行准确的数据分析。

三、试剂盒组成

荧光定量PCR Premix试剂盒(Taqman)通常包含以下主要成分：

• 定量PCR Premix试剂混合物(2X)：提供PCR反应所需的缓冲液、dNTP、热启动Taq DNA聚合酶等关键成分。
• 其他可能包括的组件：如MgCl2溶液等，具体取决于试剂盒的型号和规格。

四、使用注意事项

1. 样品处理：确保待测样品（如DNA或RNA）的纯度和完整性，避免污染和降解。
2. 引物和探针设计：根据目标基因序列设计合适的引物和探针，确保其特异性和稳定性。
3. 反应液配制：按照说明书要求准确配制反应液，避免污染和误差。
4. PCR扩增条件：根据实验需要选择合适的PCR扩增条件，如温度和时间等。
5. 荧光信号检测：使用实时荧光PCR仪监测荧光信号变化，并记录每个循环的荧光强度。
6. 结果分析：根据荧光定量曲线和标准曲线进行数据分析，计算出目标基因的初始拷贝数或相对表达量。

五、应用领域

荧光定量PCR Premix试剂盒(Taqman)广泛应用于生命科学研究及临床诊断中，包括但不限于以下几个方面：

• 基因检测：通过设计特定的Taqman探针，实现对特定基因序列的定量分析。
• 病原体检测：在病原微生物检测领域，快速、准确地检测出病原体的DNA或RNA序列。
• 药物研发：在药物研发过程中，用于药物靶点的验证、药物作用机制的研究等方面。

 
【前言】
本试剂盒提供了进行简便、灵敏的荧光 PCR 检测的完整系统，包含了经过优化的缓冲液、dNTP、热启动 Taq DNA 聚合酶混合物、MgCl2溶液，成为一个即时可用的混合物。您不必再花费时间去混合试剂，同时确保了结果的一致性和可重复性。本试剂盒使用 Biotnt 定量 PCR Premix 试剂可进行实时荧光 PCR 检测，获得方便、灵敏和准确、可靠的检测结果。

【试剂盒组成】
定量 PCR Premix 试剂混合物(2X): 1.00 ml/支，1 支 ；
定量 PCR Premix 试剂混合物(2X): 1.00 ml/支，5 支。

【其他需要使用的仪器和耗材】
1. 仪器：混匀器，real time PCR 仪，离心机；移液器（10μL ，200μL，1000μL）；冰盒；
2. 耗材：1.5mL Eppendorf 管（无菌、无酶、RNase-free；）；Tips(RNase-free) （1000μL、200μL 的枪头；
3. PCR 水（进口无菌无酶管分装）；或者无菌无酶的 dd 水；
4. 手套，口罩。
5. 本制品使用前请于-20℃保存，融解后的制品请于冰上放置，使用后请立即保存于-20℃。
6. 反应液的配制、分装请一定使用新的（无污染的）枪头、Microtube 等，尽量避免污染。
7. 引物设计过程中尽量避免发夹结构、引物二聚体结构的发生。目标片断最好在 250bp 以内，尽可能在 150bp 以内。
8. 在操作中，应使用不含荧光物质的一次性手套(经常替换)、一次性薄壁进口 200μl PCR管、移液器头(带滤嘴自卸式)，不能用手直接触摸 PCR 反应管。
9. 操作台、移液器、离心机、扩增仪等仪器设备应经常用 10%次NaClO3及/或 70%乙醇擦拭消毒。实验房间、超净工作台应定期及每次实验后用紫外灯处理。
10. 试剂盒请在保质期内使用。
11. 配制反应体系过程中若需标记，请在试管架或离心机管架上标记，不要直接标记在离心管上。
12. 实验中涉及的有害有毒的标本及试剂应妥善放置，专人保管；废弃物应置专门容器中，妥善处理。
13. 配制反应体系时，应注意移液器的使用方法，所有的液体都要缓慢加至管底，不要加至管壁，所有液体的混匀要用振荡器进行，不能用移液器吹打，避免产生气泡。如果 产生气泡，请用手指        将气泡弹破，再低速离心。反应体系配制完毕后低速离心数秒，立即进行 PCR 扩增。

【进行完整的 real time PCR 实验，还需要准备的其他产品】
1、DNA 样品（CDNA 或者基因组 DNA）
2、引物和探针，引物和探针应该 PAGE 或者 HPLC 纯化；

【反应液配制】
以 20ul 反应体系反应体系为例，一支 1ml premix 可以进行 100 tests 的实验；

反应液组份	用于荧光 PCR 实验
	加量 (μl)	终浓度	备注
定量 PCR Premix 试剂混合物(2X)	10	1×
上游引物		50-900nM	用户提供
下游引物		50-900nM	用户提供
探针		100-200nM
待检 DNA 样品		1~10ng（2）	用户提供
PCR 水	补足		用户提供
总体积	20

1) 通常初次使用本试剂时，可用引物浓度 300nM，探针浓度 150nM 进行实验，根据实验结果具体情况，在 200-800nM 范围内调整引物浓度，在 100-200nM 范围内调整探针浓度以达到最佳检测效果。
2) 如果欲使用本制品进行 2 Step RT-PCR 反应的第二步 PCR 扩增反应，第一步的 RT反应液作为 DNA 模板时的添加量不要超过 PCR 反应液总体积的 10%。
3) 部分仪器可以使用 10ul 或者 5ul 的反应总体积，反应液配制可以等比例进行缩小；也可以得到好的实验结果。需要注意的是：体积越小，同样的加样误差给结果带来的影响越大，需要采用更精密的加样器；并尽量采用大体积 mix 的配制方式；有关如何提高实验的重复性，请与 Biotnt 联系。
4) 适用的荧光定量 PCR 仪：ABI，MJ RESEARCH,BIORAD,STRATAGENE，Roche480仪器等各类 real time PCR 仪器；

【扩增条件】
以 ABI7300,7500,7900，stepone，plus 为例，Detector 设为 SYBR,QUENCHER设为 NONE,

1、 当引物 TM 值在 58℃以上，推荐：
95℃ 5 分钟→95℃ 30 秒→60℃ 1 分钟（读板）
                          40～50 个循环（可选）

2、当引物 TM 值在 58℃以下，推荐：
95℃ 5 分钟→95℃ 30 秒→55℃ 45 秒→72℃ 1 分钟（读板）
                             40～50 个循环（可选）

1) 客户自己设计合成的引物：
请根据您自己设计的引物的退火温度，选择合适的实验退火温度；根据您的仪器，选择
合适的持续时间和读板时间；
注意 1：不同仪器对读板时间要求不同，部分仪器如果读板时间太短，会导致没有荧光信号读出；必须注意这一点；可以根据机器的不同，缩短每步的时间，但黑体字部分的 95℃ 5分钟必须保留；
注意 2：本 mix 采用的是化学法修饰的 hot start 酶，该酶保证了 real time PCR 实验的特异性，并降低了实验操作难度（反应液配制时不需要在冰上操作，加样时间即使比较久，非特异性反应很少）；但必须有 95℃ 5 分钟这一步；否则会导致后面的反应不能进行，没有信号检测出；

【加样的注意事项】
1、 注意加样枪的使用，加样时不要把枪头伸入液面下，避免挂液误差；
2、 要使用低吸附的进口枪头，避免每次的残留导致的加样误差。
3、 正确的加样方式：离液面 1-2mm，加液，不靠壁，不贴液面。

【使用注意事项】
冻结制品融解后请上下颠倒轻轻均匀混合，避免振荡器等剧烈搅拌。混匀制品后请用离心机轻微离心后使用。应在使用前应充分融化，混匀，离心数秒，使液体集中在离心管底部。